使用10x Genomics Chromium微流控系统，，，，，，实现通过序列标签区别差别细胞和转录本。。。。。微流控系统通道直径很小一次通过一个细胞。。。。。首先在通道中加入带有标签的凝胶微珠，，，，，，单个细胞和单个带有标签的凝胶微珠连系，，，，，，二者被加入的油包裹到一个液滴中，，，，，，形成油包水系统。。。。。凝胶微珠上带有大宗包括凝胶微珠特异性Barcode序列、分子特异性UMI序列和polyT序列的引物序列，，，，，，将细胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕获，，，，，，扩增后形成携带有Barcode和UMI序列的cDNA，，，，，，即可实现将差别细胞泉源的差别mRNA分子加上标签。。。。。
Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，，，，，，每个微珠外貌携带有几十万个Oligo序列（如下图）。。。。。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；；；；；；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带差别的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；；；；；；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序枚举行绝对定量，，，，，，阻止扩增爆发偏好；；；；；；第四段是30bp的ployT，，，，，，用于捕获有ployA尾的转录本。。。。。
对制备好的单细胞悬液先举行质检，，，，，，质检及格后与Gel Beads和油划分加入到Chromium Chip G的差别通道，，，，，，经由微流体“T字”交织系统形成GEM。。。。。接着细胞裂解，，，，，，Gel Beads自动溶诠释放大宗引物序列，，，，，，与带有PolyA的mRNA举行逆转录，，，，，，天生带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。。。。。
样本起始量与送样建议
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组织类型 |
新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织 |
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细胞巨细 |
＜40 μm |
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细胞活性 |
>85%（只管去除细胞团/碎片/杂质等） |
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细胞浓度 |
700~1200 cells/μL |
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细胞总量 |
＞5万 |
注重事项：详细样本准备指南，，，，，，请联系在线客服。。。。。
生物信息学剖析内容
代表性文章
【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：单细胞剖析显示肝癌干细胞的异质性
论文问题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
揭晓杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，，，，，，手术切除肿瘤样本P1
手艺手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选
研究配景
肝细胞癌（HCC，，，，，，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，，，，，，hepatic cancer stem cells）的保存。。。。。 由种种细胞外貌标记物界说的差别CSC群体可能包括差别的致癌驱动因素，，，，，，这在界说靶向疗法时组成了挑战。。。。。 研究职员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功效剖析用以评估CSC的异质性水平。。。。。效果批注，，，，，，CSC在单细胞水平上的表型、功效和转录均保存异质性性，，，，，，差别的CSC亚群具有差别的分子特征。。。。。并且有趣的是，，，，，，差别CSC亚群内的差别基因与HCC预后相关，，，，，，并且相相互互自力，，，，，，批注CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤希望。。。。。
文章效果
大宗数据批注CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等外貌标记物可以界说CSC，，，，，，研究职员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7差别细胞亚群，，，，，，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。。。。。免疫荧光染色批注，，，，，，在两种细胞作育形态下（单层作育、球体作育）,两个HCC细胞系均体现出显着的细胞异质性。。。。。
HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数划分是1343、1134）正常作育和缺氧作育（增进细胞干性）2周后，，，，，，研究职员遵照三种外貌标记物（CD24、CD133、EpCAM）分选细胞，，，，，，HuH1和HuH7中标记物阳性的CSCs比例划分为15-20%、8-12%，，，，，，而标记物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），，，，，，作育后差别细胞亚群的自我更新能力差别很大（下图C-D）；；；；；； 分选后的细胞经由1个月作育后，，，，，，和未分的得细胞相比，，，，，，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+细胞能够扩大成为混淆CSCs，，，，，，而存活下的Triple-细胞能够扩大成混淆CSCs，，，，，，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，，，，，，或者标记阴性细胞履历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。。。。。
研究职员接纳SMART-Seq方法剖析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、10细胞混淆测序、100细胞混淆测序）信息，，，，，，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了较量，，，，，，发明差别细胞类群具有差别的基因表达模式，，，，，，且差别类型细胞中每个细胞的基因表达模式均保存差别，，，，，，HuH7细胞间差别大于HuH1；；；；；；当细胞混淆（10细胞混淆、100细胞混淆）后这种差别水平显着降低（下图A）。。。。。而当单独聚类HuH7细胞时，，，，，，发明差别标记细胞相互可以区分（下图B）。。。。。以上数据均批注单细胞水平上转录组保存异质性。。。。。
研究职员较量了HuH7阳性标记细胞（Triple+）和阴性标记细胞（Triple-）基因表达差别，，，，，，判断到的286个Triple+相关基因可以展望来自LCI行列的240例肿瘤样本、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生涯率，，，，，，但在非肿瘤样本中无意义。。。。。
差别标记CSC细胞群体基因表达较量剖析，，，，，，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特征基因基本不重合（下图A），，，，，，IPA通路剖析也批注差别细胞群体的通路也不重合（下图C-F），，，，，，并且差别细胞群体特征基因可以用于生涯期展望，，，，，，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。。。。。
为了整体相识细胞群体多样性，，，，，，研究职员接纳10X 单细胞测序方法，，，，，，对3847个HuH1、HuH7、P1细胞举行了剖析，，，，，， HuH1可以分为2个亚群，，，，，，HuH7分为4个细胞亚群，，，，，，P1分为3个细胞亚群，，，，，，细胞聚类效果与与SMART-seq效果类似（下图A）。。。。。CSC标记物，，，，，，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，，，，，，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下图C）在差别细胞亚群中表达保存异质性。。。。。P1的3个细胞亚群中表达了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC)，，，，，， 干细胞marker (NANOG)，，，，，，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，，，，，，但其表达也保存异质性，，，，，，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（划分表达T细胞marker和B细胞marker），，，，，，第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）。。。。。
参考文献
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
效果展示
1. 单细胞亚群分类
针对PCA效果中选取前10个主因素，，，，，，接纳graph-based聚类要领对细胞举行分类。。。。。使用相同的数据举行t-SNE剖析，，，，，，然后将聚类效果在t-SNE映射中展示。。。。。
2. Marker基因剖析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图
3. 差别基因KEGG富集性剖析
Pathway通路图展收说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差别表达转录本，，，，，，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差别表达转录本，，，，，，橘黄色代表注释到某个ko节点不但有上调又有下调的显著差别表达转录本。。。。。方框内的4位数字体现种种酶的EC编号；；；；；；空心圆圈体现小分子化合物；；；；；；实心箭头体现生化反应的偏向；；；；；；虚线箭头毗连其他的相关代谢途径。。。。。下图仅为报告中的展示图片
常见问题（FAQ）
1、单细胞转录组测序需要做重复吗？？
单细胞测序的目的在于判断细胞群体中的差别亚群、获得新的主要分子标记物和判断有数细胞亚群等，，，，，，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。。。。。从现在已有的文献看，，，，，，对重复数没有强制要求。。。。。但从近期的发文趋势来看，，，，，，建议每组设置样本数3~5 个，，，，，，临床样本凭证现真相形建议每组 5 例以上。。。。。
2、组织样本怎样制备单细胞悬液？？
单细胞转录组测序现在没有一个统一的样本制备要领，，，，，，针关于差别的组织样本，，，，，，有差别类型的样本单细胞制备要领。。。。。别的，，，，，，可以详细凭证先生提供的详细样本类型，，，，，，查阅相关的文献，，，，，，探讨适合于先生样本的单细胞悬液制备要领。。。。。
3、单细胞转录组每个细胞能捕获到几多个基因？？
凭证差别的细胞类型，，，，，，捕获到的基因数会有区别，，，，，，有些细胞类型高的会在3000左右，，，，，，而有些或许在1000左右。。。。；；；；；；蚣斐鍪胙咀刺泄兀，，，差别类型的样本，，，，，，基因检出数可能保存数倍的差别。。。。。
