光遗传学（optogenetics）是连系了光学（optics）及遗传学（genetics）的手艺，，借助其，，我们能在活体动物甚至是自由运动的动物脑内、脊髓、外周神经内，，精准地控制特定种类神经元的运动。。 。光遗传学在时间上的准确度可抵达毫秒级别，，在空间上的准确度则能抵达单个细胞级别。。 。2010年，，光遗传学被Nature Methods选为年度要领，，同年被Science以为是近十年来的突破之一。。 。这项手艺现在在神经科学领域应用很是普遍，，未来可能会应用于多种神经和精神疾病的治疗，，如帕金森氏病、阿尔茨海默病、癫痫、脊髓损伤、精神破碎症等。。 。
图1.光遗传学手艺
1）光遗传学手艺生长史
谈及光遗传学手艺的由来，，我们不得不思索神经科学的基本研究需求：准确控制神经元运动。。 。1979年，，诺贝尔奖得主Francis Harry Compton Crick首次提出，，为相识大脑怎样运作，，我们需要一种要领，，可以每次只让某一特定类型神经元运动被抑制，，而不影响其他神经元的运动。。 。为了实现这个目的，，人们已往通常接纳电刺激来激活一群神经元运动，，但其具有两浩劫以战胜的弱点（图2），，其一在于该操作的非选择性，，即电场会同时刺激多种类型神经元，，所得出的研究效果往往缺乏特异性，，其二是只能激活而无法抑制神经元运动。。 。随着基因工程手艺的生长，，科学家最先使用化学药物联合转基因手艺来准确定位特定的神经元并举行相关研究，，只管解决了特异性问题，，可是化学刺激的要领在时间上的准确度缺乏包管。。 。因而，，一种高准确性，，能够激活或抑制特定种类神经元运动的要领成为研究的“刚需”，，光遗传学手艺正解决了此问题。。 。
图2 光遗传学与电刺激操控细胞的差别（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）
早在1973年，，微生物学家便发明细菌视紫质（Bacteriorhodosin）光照之后会成为离子转运卵白，，1977年发明盐细菌视紫红质（Halorhodopsin，，NpHR）也是离子转运卵白，，照黄绿光后会将阴离子打进细胞，，2002年发明光敏感通道（Channelrhodopsins），，蓝光照射之后会将阳离子打进细胞。。 。
2005年9月份，，斯坦福大学的Karl Deisseroth实验室在Nature Neuroscience上揭晓了一篇Technical Report，，第一次将Channelrhodopsin-2（ChR2）表达在神经元里，，发明可以用蓝光准确地控制神经元的运动（图2），，而光遗传学（optogenetics）一词也随之泛起。。 。随后发明Bacteriorhodosin与Halorhodopsin也都能在神经元表达，，准确调控神经元的运动，，并不会对神经元爆发迫害作用。。 。以后，，光遗传学迅速改变神经科学界，，成为研究特定神经元在大脑中饰演何种角色不可或缺的工具。。 。
图3.将ChR2表达在神经元膜上，，然后用470nm蓝色激光举行照射
2）光遗传学手艺基来源理
简朴地说，，光遗传学手艺即借助遗传学手段，，将能够对光起响应的通道表达在特定细胞中，，实现通过光来激活或抑制神经元运动的目的。。 。其中，，激活或抑制的原理在于差别通道对阳离子或阴离子的通透（图4）：若是转入细胞的通道是ChR通道，，那么在细胞接受蓝色激光照射时通道开放，，阳离子内流，，会爆发去极化电位，，诱刊行动电位的发出，，激活细胞；；；；；若是转入细胞的是HR一类通道的话，，细胞接受黄色激光照射时阴离子内流，，爆发超极化电位，，导致行动电位不易发放，，抑制细胞运动；；；；；别的，，尚有一类光激活或抑制的通道optoXR，，给光激活后其改变的是胞内激酶系统，，影响细胞运动。。 。因此，，光遗传学手艺的焦点手艺差别在于光敏感通道的选择。。 。
图4.光遗传学的基来源理（以ChR2和NpHR为例）
3）常见的光敏感通道
几种激活神经元的通道卵白：
1、ChR2(H134R)：ChR2的突变体，，将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，，该卵白质可以爆发两倍的光电流，，但通道开关速率也比野生的ChR2慢了一倍；；；；；
2、ChR2(C128S/D156A): ChR2的突变体，，超迅速光敏感通道，，用蓝色激光翻开通道，，然后用绿色或黄色激光关闭通道，，可以翻开其离子通道长达30分钟；；；；；
3、ChR2(E123T/T159C): ChR2的突变体，，更大的光电流和更快的动力学转变；；；；；
4、ChETA：ChR2的突变体，，使得神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike，，而其他的ChR2 通道卵白只能抵达40Hz；；；；；
5、C1V1：由ChR1及由团藻发明的VChR1组合在一起的通道卵白，，在红色激光刺激下翻开通道；；；；；
6、oChIEF：响应高频光（--100Hz）刺激，，加速通道关闭的速率，，在一连光照刺激下镌汰失活率；；；；；
7、ST-ChroME：胞体定位，，激活型ChroME通道。。 。
几种抑制神经元运动的通道卵白
1、NpHR：即为Halorhodopsin，，第一个有用抑制神经元运动的光遗传学工具，，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，，而抑制神经元运动。。 。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，，会群集在内质网上，，而若是将内质网输出元件加在NpHR基因序列后面，，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，，并且不会群集在内质网上，，这样修悔改的NpHR被称为eNpHR2.0。。 。可是eNpHR2.0在细胞膜的群集仍然不敷，，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量群集，，这样修悔改的NpHR被称为eNpHR3.0，，eNpHR3.0的响应时间短，，反应迅速。。 。
2、Arch：即为archaerhodopsin，，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外情形中，，使神经元处于超极化状态。。 。在特定条件下，，可用于增添细胞内pH或镌汰细胞外基质pH。。 。和NpHR相比，，当激光关闭的时间，，Arch连忙从通道翻开状态恢复到关闭状态。。 。
3、Mac:即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，，蓝色激光激活的质子泵，，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外情形中，，使神经元处于超极化状态。。 。
4、IRES-ST-eGtACR1：胞体定位，，快速抑制。。 。
图5常见光敏感通道特征（Karl Deisseroth’s, Nat Methods,2012）
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4）光遗传学手艺的应用战略
借助病毒载体的光遗传学手艺应用一样平常包括以下几个要害办法（图6）：
1、 凭证实验需求寻找合适的光敏卵白；；；；；
2、通过病毒载体熏染细胞，，将光敏感通道表达在靶细胞中；；；；；
3、手术手段向脑中导入光纤，，通过控制激光来实现对神经元运动的精准控制；；；；；
4、选择合适的病毒表达时间，，连系行为实验设置合理的试验计划；；；；；
5、行为学手段或电心理手段验证。。 。
图6. 光遗传学手艺的一样平常战略（Karl Deisseroth, Scientific American, 2010）
5）光遗传学手艺优势
1、时间准确度高：光遗传手艺可以通过控制激光使时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级；；；；；
2、刺激的强度准确性高：光遗传手艺通过控制激光，，可以精准地、随时地调理给神经元刺激的强度，，这关于某些刺激强度依赖的神经环路研究有不可替换的优势；；；；；
3、空间特异性：光遗传学手艺可以通过脑定位注射、特异性启动子、甚至是亚细胞器定位肽，，将光敏感卵白锚定在靶向细胞或细胞器举行操作，，可抵达单个细胞的级别，，实现精准定位；；；；；
4、作用工具多样：现在人们已经突变了一系列新的光敏感通道，，这些通道的时间特征和引发光要求都差别，，可凭证详细的实验需求举行选择；；；；；
5、作用直接：不像DREADDs手艺依赖于动物代谢水平，，光遗传学手艺通过激光操控细胞的激活或抑制，，作用直接。。 。
表1 光遗传与化学遗传优弱点较量
光遗传学手艺 DREADDs手艺
时间上 时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级 小时级，，可实现长达数小时一连激活或抑制神经元运动而不影响细胞正常心理
空间上 通过脑定位注射、特异性启动子、亚细胞器定位肽，，将光敏感卵白锚定在靶向细胞或细胞器举行操作，，可抵达单个细胞的级别 通过定位注射、特异性启动子将DREADDs受体锚定某类特定的细胞
操作手艺 开颅手术埋置光纤，，需要光纤、激光控制器等，，操作相对有难度 非浸入性，，只需通例药理学手艺手法，，注射或者喂食CNO即可
光遗传学应用案例
1、oChIEF：
客户揭晓文章：Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]
注射部位：小鼠LHb
载体：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29× 1012 VG/mL
注射体积：100nl
视察时间：1个月
2、ChR2(H134R)& eNpHR3.0
客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]
注射部位：小鼠脊髓
载体：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry& AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.1× 1012 VG/mL&1.7× 1013 VG/mL
注射体积：400-600nl
