化学遗传学手艺（或称药理遗传学手艺）是近年来与光遗传学一起泛起的主要新手艺。。。。。该手艺通过对一些生物大分子实验刷新，，，使其能和先前无法识别的小分子举行相互作用，，，从而抵达可控、可逆（可以随时加入或除去化合物，，，从而启动或中止特定的反应）控制生物大分子的活性，，，该手艺已经在信号转导、药物开发、功效基因组学等方面的研究中获得了普遍的应用。。。。。
他们被普遍用于以细胞特异性、无创地增强或抑制神经元的运动。。。。。虽然DREADD缺乏像光遗传学那样精准的时间控制能力，，，可是由于在举行疾病治疗时，，，最有可能需要的是恒久神经元环路调理，，，而DREADDs会很是适合这类应用。。。。。别的，，，许多FDA批准药物的目的作用目的是GPCRs，，，而DREADDs是刷新过的GPCRs，，，因此DREADDs可能会在药物开发方面提供富厚的可能性。。。。。
现在已刷新的生物大分子包括核酸杂交、卵白质激酶、种种代谢酶和G卵白耦联受体（G protein?coupledreceptors，，，GPCRs）。。。。。现在有许多基于GPCRs刷新的化学遗传学平台，，，例如1991年构建的基因编码受体的等位基因特异激活（Allele-specific activation of genetically encoded receptors）、1998年构建的只能被合成配体激活的受体（Receptorsactivated solely by synthetic ligands, RASSLs）、基因工程刷新的受体（Engineered receptors）和2007年构建的只由特定药物激活的受体（Designer receptors exclusively activatedby designer drugs，，，DREADDs）。。。。。其中，，，DREADDs已成为应用最普遍的化学遗传学手艺，，，本文也将主要讨论DREADDs手艺。。。。。
图1.化学遗传学手艺
1）DREADDs手艺
DREADDs手艺是由Bryan L. Roth等人发明的，，，他们改变了G卵白偶联受体—乙酰胆碱受体的结构，，，改变后其只能被特定的化合物Clozapine-N-oxide（CNO）激活或者抑制。。。。。此类改变的受体会选择性地作用于差别的GPCR级联反应，，，包括Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，，，其中应用最普遍的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。。。。。通过将上述受体在细胞内表达，，，在CNO的作用下，，，其爆发的效果各不相同。。。。。
图2 常用的几种DREADDs受体作用原理（Scott M. Sternson & Bryan L. Roth, Annu. Rev. Neurosci., 2014）
2）常见的DREADDs受体
1、Gq-DREADD和hM3Dq：
最初的Gq-DREADD即hM3Dq，，，刷新自人毒蕈碱型乙酰胆碱受体（the human muscarinic acetylcholine receptor，，，mAchRs）亚型M3（也称为hM3）。。。。。在正常心理状态下，，，hM3和乙酰胆碱连系，，，然后和Gq类G卵白耦合受体耦合，，，作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞内钙离子这一信号通路（图3）。。。。。
令人受惊地是，，，只要将Y3.33C和A5.46这两个位点突变，，，就能使hM3受体不可和乙酰胆碱耦合，，，可是会和纳摩尔浓度级别的CNO连系，，，这种突变后的hM3受体被命名为hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。。。。。由于Y3.33和A5.46在差别的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型中是守旧的，，，M1和M5也已经被乐成刷新为Gq-DREADD（hM1Dq和hM5Dq）。。。。。可是到现在为止，，，hM3Dq仍然是应用最多的Gq-DREADD。。。。。
在差别的细胞类型中，，，CNO诱导hM3Dq的效果是纷歧样的，，，好比：1) 在成熟神经元中，，，CNO诱导hM3Dq的效果是将神经元去极化（depolarization），，，增强神经元的兴奋性，，，这也是hM3Dq最常用的功效，，，即促使神经元的放电运动；；；2) 在星形胶质细胞中，，，有人报道CNO诱导hM3Dq的效果是增添星形胶质细胞Ca+的释放，，，从而改变自主神经系统的心理条件；；；3) 在神经系统以外，，，也有一些研究，，，例如在胰腺Β细胞表达hM3Dq，，，急性CNO处置惩罚会增进胰岛素的释放，，，而慢性CNO处置惩罚导致Β细胞数目增添；；；在肝细胞中，，，激活hM3Dq会增添血糖水平，，，也许是由于糖原剖析和糖异生作用增添。。。。。
图3. hM3和乙酰胆碱连系，，，作为信号分子激活Gq耦联的GPCRs信号通路
2、Gi-DREADD和hM4Di:
Y3.33和A5.46在差别的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型中是守旧的，，，因此科学家同样可以突变M2和M4 mAchRs上的Y3.33、A5.46位点，，，由于M2、M4的下游激活的是Gi通道，，，于是爆发Gi- DREADDs，，，命名为hM2Di和hM4Di，，，他们可以激活Gi调理的信号通路（图4）。。。。。
Gi耦合的GPCRs可以激活G卵白内向整流钾通道（GIRK），，，在CNO的作用下，，， hM2Di和hM4Di受体被激活可以抑制神经元的放电运动，，，其中使用最多的Gi-DREADD是hM4Di。。。。。也有研究批注，，，hM4Di可以抑制神经递质的释放，，，从而抵达抑制神经元运动的效果。。。。。
图4 hM4和乙酰胆碱连系，，，作为信号分子激活Gi耦联的GPCRs信号通路
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3）DREADDs手艺的应用战略
借助病毒载体的DREADDs手艺应用一样平常包括以下几个要害办法（图5）：
1、 凭证实验目的，，，确定合适的DREADDs受体，，，一样平常来说，，，激活神经元选择hM3Dq，，，抑制神经元选择hM4Di；；；
2、借助病毒载体在动物体内表达DREADDs受体；；；
3、设计实验计划，，，在合适的时间窗口内给予动物CNO药物，，，激活受体，，，给予CNO的方法包括脑内定位注射、腹腔注射和喂水；；；
4、表型检测，，，通过行为学或电心理手段等检测神经元运动转变带来的转变。。。。。
图5. DREADDs手艺的一样平常战略
4）DREADDs手艺优势
DREADDs手艺和光遗传学手艺应用起来很是靠近，，，其目的也是同样的，，，那么，，，我们一样平常研究中怎样对其举行选择？？ ？选择的标准就是两种手艺的优弱点剖析：
DREADDs手艺的优势主要有：
1、实验要求较低，，，操作简朴：不像光遗传学手艺需要光纤、激光控制器等，，，DREADDs手艺只需通例药理学手艺手法，，，注射或者喂食CNO即可；；；
2、非侵入性：不像光遗传手艺需举行开颅手术埋置光纤，，，因此不会由于特殊负重影响小鼠行为，，，可实现在小鼠完全自由运动的情形下调控特定脑区和特定神经元的运动；；；
3、实现长时间激活或抑制神经元运动：由于两种手艺原理差别，，，光遗传学手艺依赖的是光敏感通道的开放，，，是需要离子在细胞膜上的流动爆发电位转变，，，影响神经元运动，，，而长时间离子逆浓度差收支细胞需消耗大宗ATP（如离子泵），，，这会导致细胞受损殒命，，，别的光刺激的热效应同样会损伤细胞。。。。。相比之下，，，DREADDs表达的是一种受体，，，可以长达数小时一连激活或抑制神经元运动而不影响细胞正常心理；；；
4、清静性高：CNO是FDA批准上市药物-氯氮平的代谢产品，，，体内应用相对清静。。。。。别的，，，许多FDA批准药物的目的作用目的是GPCRs，，，而DREADDs是刷新过的GPCRs，，，因此DREADDs可能会在药物开发方面提供富厚的可能性。。。。。
表1 光遗传与化学遗传优弱点较量
光遗传学手艺 DREADDs手艺
时间上 时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级 小时级，，，可实现长达数小时一连激活或抑制神经元运动而不影响细胞正常心理
空间上 通过脑定位注射、特异性启动子、亚细胞器定位肽，，，将光敏感卵白锚定在靶向细胞或细胞器举行操作，，，可抵达单个细胞的级别 通过定位注射、特异性启动子将DREADDs受体锚定某类特定的细胞
操作手艺 开颅手术埋置光纤，，，需要光纤、激光控制器等，，，操作相对有难度 非浸入性，，，只需通例药理学手艺手法，，，注射或者喂食CNO即可
DREADDs手艺应用案例
1、hM4Di
① 客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]
注射部位：小鼠PBN
载体：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL
注射体积：150nl
视察时间：3周
② 客户揭晓文章：Neuron . (IF=14.319). Xu HF, et al. (2019) A Disinhibitory Microcircuit Mediates Conditioned Social Fear in the Prefrontal Cortex. [社交恐惧症, AAV，，，化学遗传]
注射部位：小鼠PrL
载体：AAV2/9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
血清型：AAV2/9
病毒滴度：3.44× 1013 VG/mL
注射体积：100-200nl
视察时间：4周
