有“毒”？？ ？？？内毒素—rAAV载体的“毒”中“毒”
什么是内毒素？？ ？？？
内毒素(Endotoxin)：又称脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，，由脂质A、菌体特异性多糖和非特异性焦点多糖三部分组成，，是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成因素，，单位EU/mL。。。。内毒素对宿主是有毒性的，，脂质A是内毒素的主要毒性组分。。。。
图1 内毒素分子结构（紫色方框所示,图片泉源参考文献4）
rAAV载体中为什么会含有内毒素？？ ？？？
内毒素的释放是由细菌殒命自溶或粘附在其他细胞时造成的，，也会爆发在正常细胞生长和破碎历程中。。。。在rAAV载体制备历程中，，内毒素污染主要有两种泉源：细菌内毒素和情形内毒素。。。。由于rAAV生产所需要的质粒DNA是从大肠杆菌中疏散提取的，，因此质粒DNA可能含有少量内毒素；；同时，，rAAV制备历程中需转染293T细胞，，而细胞的生长破碎可能也会带来内毒素的爆发；；别的，，生产历程中的情形污染可能亦会引入内毒素。。。。
rAAV载体中的内毒素怎样检测？？ ？？？
凭证药物生产的规范要求，，基于鲎试剂的内毒素测定是检测内毒素残留的金标准。。。。鲎是一种海洋节肢动物，，身体呈青褐色，，血液呈淡蓝色，，鲎的血液一遇到细菌就会凝固。。。。因此，，人们使用这一特点开发出鲎试剂，，即将鲎血液中的变形细胞举行消融，，将消融物制成含有能被微量内毒素激活的凝固酶原产品，，通过判断内毒素导致的污浊效应测试内毒素含量。。。。
通常，，鲎试剂变性细胞溶液交联测定的敏感度是0.06个单位的内毒素EU/mL。。。。测试样品用重蒸水两倍稀释使用，，测定试剂（11uL）加入到rAAV溶液，，作育在37℃，，60min，，试管检测胶块的泛起，，检测阳性和阴性效果。。。。
内毒素对宿主的影响
内毒素对宿主是有毒性的，，纵然是少量的内毒素也可能会诱导宿主爆发免疫反应。。。。内毒素可以与细胞膜上的受体连系引起免疫反应，，激活组织内的炎性细胞和炎症因子的释放，，对细胞有较强的毒性作用，，影响体内外细胞的生长和功效。。。。在体内情形下，，内毒素作用于哺乳动物，，可导致机体发热，，引发全身性炎症反应，，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功效衰减等，，最终导致殒命。。。。因此，，无论是涉及病毒载体的实验研究照旧临床应用，，我们都需要只管去除载体的内毒素。。。。
怎样有用去除rAAV载体中内毒素
在病毒的生产中，，内毒素的去除包括亲和层析、缓冲液洗涤等要领，，亲和层析法去除内毒素具有耗时、本钱高、载体接纳率差等弱点。。。；；撼逡合吹庸嬖蚴墙柚嘶蚶胱咏涣魃资枭PS胶束，，经由多次缓冲液交流洗涤，，再用低速离心浓缩病毒作育液的方法去除rAAV载体内毒素，，该要领现在在部分rAAV血清型中适用。。。。无论哪种要领都有一定的局限性，，因此，，从源头上去除内毒素至关主要。。。。
基于12年、30000+的病毒生产履历，，UG环球生物一连优化病毒生产全流程，，建设标准三级细胞库，，每月替换细胞，，包管代次，，一连降低rAAV载体的内毒素；；同时，，我们选择GMP级的质粒完成病毒包装，，从源头上控制内毒素的爆发。。。。在现实事情中，，多次、随机检测的rAAV载体内毒素含量均＜2.5EU/ml，，残留标准凌驾行业普遍的<10EU/ml，，为研究者提供更好的基因载体，，让基因递送触手可及。。。。
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参考文献
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[2]Liudmyla Kondratova, et al., Removal of Endotoxin from rAAV Samples Using a Simple Detergent-Based Protocol. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Sep 6;15:112-119.doi: 10.1016/j.omtm.2019.08.013.
[3]Jihad El Andari, et al., Production, Processing, and Characterization of Synthetic AAV Gene Therapy Vectors. Biotechnol J. 2021 Jan;16(1):e2000025.doi: 10.1002/biot.202000025.
[4] Rita F Maldonado, et al., Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbiol Rev. 2016 Jul;40(4):480-93.doi: 10.1093/femsre/fuw007.
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