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脑科学研究的要害是要实现对神经元集群活动的实时视察，，，，，，并通过特定神经环路的结构追踪及其活动使用，，，，，，研究其对脑功效的充分性和须要性，，，，，，进而在全脑标准上剖析神经环路的功效和结构。。
钙离子成像手艺
钙离子成像手艺（Calcium imaging）是指使用钙离子指示剂监测组织内钙离子浓度的要领，，，，，，常用于神经系统的研究，，，，，，指示神经元内钙离子的转变，，，，，，提醒神经元活动。。其原理在于借助钙离子浓度与神经元活动之间的严酷对应关系，，，，，，使用特殊的荧光染料或者卵白质荧光探针（钙离子指示剂，，，，，，Calcium indicator），，，，，，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度体现出来，，，，，，并被显微镜捕获，，，，，，从而抵达监测神经元活动的目的。。
因而，，，，，，钙离子成像手艺的焦点在于钙离子指示剂，，，，，，现在普遍使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂（chemical indicators）和基因编码钙离子指示剂（genetically-encoded indicators）两类：
1、化学性钙离子指示剂：指的是可以螯合钙离子的小分子，，，，，，所有这些小分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），，，，，，BAPTA能够特异性地和钙离子螯合，，，，，，而不会和镁离子螯合，，，，，，以是被普遍地用作钙离子螯合剂。。现在较为成熟的化学性钙离子指示剂包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。。
2、基因编码钙离子指示剂：这些指示剂是来自于绿色荧光卵白（GFP）及其变异体（例如循环排列GFP、YFP、CFP）的荧光卵白质，，，，，，与钙调卵白（CaM）和肌球卵白轻链激酶M13域融合。。现在使用较普遍的基因编码钙离子指示剂有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，，，，，，其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度，，，，，，现在被普遍应用于活体钙成像研究，，，，，，其发出荧光的原理在于钙离子浓度上升导致M13与CaM连系，，，，，，从而改变cpEGFP的构象，，，，，，将其从无荧光的状态变为绿色荧光。。
GCaMP卵白的基本结构和原理（Jasper Akerboom, et al., Biol Chem,2009）
常见的可遗传编码钙离子指示剂
钙离子成像手艺是一类可以在活体动物视察神经元活动的手艺，，，，，，其突出优点在于能够同时视察一群细胞的活动，，，，，，借助病毒载体的特异性表达能力和神经环路标记能力，，，，，，我们还可以视察特定类型细胞的活动。。
电压成像手艺
神经元细胞膜上的电势是大脑中主要的信息载体。。因此，，，，，，监测单个神经元的电压动态，，，，，，从突触输入到轴突输出，，，，，，关于明确行为背后的神履历程是至关主要的。。
细胞的细胞膜上镶嵌的种种转运卵白和跨膜离子通道可以控制Na+、K+等离子收支细胞。。从而形成一连保存的跨膜离子浓度梯度，，，，，，由此形成的胞内外的电位差别就是膜电位。。当细胞接受外界刺激时，，，，，，膜电位会爆发转变，，，，，，而电压成像手艺的基来源理就在于通过对电压敏感的荧光指示剂 (Voltage Indicators) 直接标记膜电位转变，，，，，，再借助荧光成像手段监测神经元电活动。。
1、最初科学家们会借助古板电压敏熏染料举行神经活动的动态研究，，，，，，然而电压敏熏染料的光信号太弱，，，，，，由膜电位转变引起的染料信号转变只有静息时配景光强的万分之一到百分之一，，，，，，同时，，，，，，化学染料对细胞选择性差，，，，，，无法做到特异性对差别类型的细胞举行视察。。别的，，，，，，电压敏熏染料会导致细胞爆发永世性的转变，，，，，，甚至改变其光动力学性子，，，，，，无法对活体动物举行恒久视察。。
2、基因编码的电压指示剂（genetically encoded voltage indicators, GEVIs）：和电压敏熏染料相比，，，，，，GEVIs 最大的优势就是可以特异性地标记种种类型的神经元或亚细胞结构，，，，，，实现高时空区分率的成像事情。。GEVIs 一样平常基于以下三种事情机制：
①膜电位爆发转变时，，，，，，细胞膜上镶嵌的许多卵白质分子都会改变形状，，，，，，这类随膜电位改变形状的卵白分子叫电压敏感元件。。将电压敏感元件与荧光卵白或化学共价荧光标记卵白相连系，，，，，，形成一个嵌和卵白，，，，，，当细胞膜电压爆发改变时，，，，，，电压卵白构象爆发转变会滋扰荧光蛋鹤发色团的化学情形，，，，，，从而改变荧灼烁度。。
②基于视紫红质等视卵白（Opsin）的电压敏感荧光探针，，，，，，微生物视紫红质的吸收和荧光都是电压敏感的，，，，，，且反应迅速，，，，，，膜电位爆发转变时，，，，，，视卵白通道构象爆发改变，，，，，，进而影响视卵白的荧光爆发转变。。
③能够感知电压转变的FRET（荧光能量共振转移, fluorescence resonance energy transfer, FRET）探针，，，，，，将荧光卵白融合到电压敏感元件或视卵白上，，，，，，当细胞膜电位爆发转变时，，，，，，带电荷的有机分子会在细胞膜中移动，，，，，，从而导致相连的荧光卵白爆发荧光共振能量转移效应，，，，，，改变其荧灼烁度。。
三种类型GEVIs的示意图
（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）
电压成像病毒列表
神经元功效成像是探讨神经元编码种种功效的主要科学手段，，，，，，现在最常用要领为钙成像和电压成像。。然而，，，，，，神经元钙信号衰减很慢，，，，，，不可充分表征行动电位与阈下电位。。唬唬基因编码的电压指示剂（GEVIs）能够以高空间和时间区分率监测神经元的快速放电信号与阈下电活动，，，，，，实时监测细胞膜电位的波动，，，，，，相比于钙指标，，，，，，更能直接反应神经元的活性。。
神经递质探针
人脑约莫有10
10-10
12个神经元，，，，，，每个神经元拥有10
3-10
4个突触与其他神经元形成联系。。神经递质作为突触间转达信息的主要“信使”，，，，，，加入多种心理历程。。神经递质的正常释放关于维持机体正常的心理功效施展着主要作用,同时,神经递质的释放与调理泛起异常时，，，，，，也经常陪同着神经退行性疾病、抑郁症等疾病的爆发生长。。因此,在分子、细胞、环路等层面准确地剖析检测神经递质是怎样加入并调理上述心理和病理历程,能够更深入地相识疾病的发病机制,并为临床药物的开发涤讪基础。。
要更好地研究这些神经递质在心理、病理历程中饰演的角色，，，，，，研究职员需要实时检测活体内特定脑区的神经递质信号转变，，，，，，看清它们的“一举一动”。。浚可遗传编码的神经递质探针的乐成开发可以实时准确的检测内源神经递质的动态转变，，，，，，为研究大脑的重大功效以及神经系统疾病机制的剖析提供主要的工具。。
由于该类探针具有可基因编码的特征，，，，，，研究者可以通过转染、病毒注射以及构建转基因动物等手段，，，，，，将新型探针表达在细胞、小鼠脑片，，，，，，以及活体果蝇、斑马鱼及小鼠中，，，，，，并连系现有的成像手艺，，，，，，把“难以捉摸”的神经递质转变情形酿成了直观、易测的荧光信号，，，，，，做到在不影响细胞正常心理功效的情形下实时准确的检测活体动物中内源神经递质的动态转变。。在此基础上，，，，，，科学家们还对探针举行了全方位的优化，，，，，，，，，，，，使具有极高的分子特异性和时空区分率（时间上抵达毫秒级，，，，，，空间上即可测得特定脑区的整体观，，，，，，也可准确至单细胞）。。
常见的可遗传编码的神经递质探针
①GRAB神经递质荧光探针：
北京大学李毓龙教授团队使用可与神经递质相连系的G卵白偶联受体（GPCR）作为探针的骨架，，，，，，乐成开发出一系列新型可遗传编码的神经递质荧光探针。。其原理在于：在 GPCR 中保存一段配体（神经递质）连系后构象改变最显著的区域，，，，，，将循环重排并对构象转变敏感的绿色荧光卵白（cpEGFP）插入到该区域中，，，，，，神经递质与GPCR的连系会引起其构象的改变,而这种转变又引起cpEGFP爆发构象的转变，，，，，，进一步影响其发色团周围的微情形,最终导致其荧光强度的改变。。
GRAB神经递质荧光探针示意图
（Li Research Lab http://www.yulonglilab.org/resources_cn.html）
②基于单荧光卵白的可遗传编码的荧光探针：融合了来自细菌中可与神经递质连系的卵白以及经由循环重排并对构象转变敏感的绿色荧光卵白(cpEGFP)，，，，，，当神经递质与探针连系后，，，，，，由于构象改变而引发cpEGFP 荧光强度的转变，，，，，，检测神经递质的释放。。
iGluSnFR结构示意图
（Marvin JS, et al., Nat Methods. 2013）
神经递质探针病毒载体列表
1、GCaMP6f
客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 醒觉]
注射部位：小鼠PVT
载体：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射体积：100nl
视察时间：4周
2、GCaMP6s
①客户揭晓文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传, 化学遗传，，，，，，钙成像]
注射部位：小鼠PBN
载体：AAV-hSyn-GCaMP6s
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.3E+12VG/mL
注射体积：300nl
视察时间：3周
②客户揭晓文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]
注射部位：小鼠皮层M1、PMC
载体：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5E+12 VG/mL；；；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2E+13VG/mL；；；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5E+12 VG/mL
注射体积：多点注射，，，，，，每位点30-40nl
视察时间：4周
3、GCaMP5G
客户揭晓文章：Neuron. (IF=14.319). Han Q,et.al. (2018). A Visual-Cue-Dependent Memory Circuit for Place Navigation. [AAV, 学习与影象, 钙成像]
注射部位：小鼠MECII
载体：pAAV-Syn-GCaMP5G
血清型：rAAV2/9
注射体积：约100nl
视察时间：4周
4、iGABASnFR探针
客户揭晓文章：Cell stem cell. (IF=20.86). Zheng J,et.al. (2018). Interneuron Accumulation of Phosphorylated tau Impairs Adult Hippocampal Neurogenesis by Suppressing GABAergic Transmission. [AAV, AD, 神经递质探针]
