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细胞功效学实验

细胞功效学实验

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细胞增殖

　　细胞增殖与细胞凋亡、细胞周期等是肿瘤研究的主要表型，，是分子生物学和药理学研究解决的问题之一。。通过在细胞中过表达或滋扰某个基因研究基因对细胞增殖能力的影响，，进一步研究基因的功效，，或对细胞举行药物处置惩罚，，研究药物对增殖的影响。。
　　实验原理(CCK-8)
　　细胞增殖是生物体的主要生命特征，，细胞以破碎的方法举行增殖，，是生物体生长、发育、滋生和遗传的基础。。细胞增殖的研究要领有许多，，主要包括：CCK8/ CellTiter-Glo™等要领。。
　　Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于轻盈而准确的细胞增殖和毒性剖析。。其基来源理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产品（Formazan dye）。。天生的甲瓒物的数目与活细胞的数目成正比。。因此可使用这一特征直接举行细胞增殖和毒性剖析。。
 
 
　　CCK-8要领优势：
　　 1 操作简朴，，阻止细胞计数历程中人为因素的影响；；；；；
　　 2 细胞用量少，，检测迅速度高，，稳固；；；；；
　　 3 可重复用酶标仪读板，，检测时间无邪，，不影响细胞举行后续实验；；；；；
　　 4 CCK-8爆发的Formazan是水溶性的，，无需换液，，尤其适用于悬浮细胞,与MTT法相比更利便，，更清静。。
　　目的：考察目的基因对细胞的增殖能力爆发的影响或药物对细胞增殖能力的影响
　　质料：目的细胞、稳转株（空载、目的基因）
　　办法：细胞网络——细胞铺板——（药物处置惩罚）——细胞作育0、6、24、48、72小时后加入CCK-8处置惩罚，，酶标仪检测
　　
　　实验原理(CellTiter-Glo™)
　　ATP腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)加入生物体内多种酶促反应，，是活细胞新陈代谢的一个指标，，其含量直接反应了细胞的数目及细胞状态：实验历程中向细胞作育基加入等体积CellTiter-Glo™试剂，，丈量发光值，，在光信号和系统中，，发光值与ATP量成正比，，而ATP又和活细胞数正相关，，因此可通过检测ATP含量得细胞活力。。
　　CTG要领优势：
　　1 同通俗的MTT、CCK8法相比，，CellTiter-Glo™发光活细胞检测系统的检测试剂具有最高迅速度和较长的信号一连时间，，此系统已经普遍地应用在生命科学研究领域中，，如一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等;
　　2 CellTiter-Glo™试剂和细胞作育中的常用作育基兼容，，如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12，，也不受酚红和有机溶剂的影响，，误差。。，准确率高。。
　　目的：考察目的基因对细胞的增殖能力爆发的影响或药物对细胞增殖能力的影响
　　质料：目的细胞
　　办法：细胞网络——细胞铺板——（药物处置惩罚）——细胞作育0、24、48、72、96小时后加入CellTiter-Glo™溶液用微孔板震荡器5分钟，，于室温安排10分钟-酶标仪检测荧光值

细胞凋亡

　　细胞凋亡是肿瘤和发育研究的重点，，同时也是药理学研究的热门。。细胞凋亡是指细胞在一定的心理或病理条件下，，遵照自身的程序，，自主竣事其生命的历程。。它是一个自动的，，高度有序的，，基因控制的，，一系列酶加入的历程。。细胞凋亡的历程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→卵白水解酶的活化（Caspase）→进入一连反应历程。。
　　基来源理
　　细胞凋亡检测接纳Annexin V/PI双染法检测，，Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂连系卵白，，能与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，，PS）高亲和力特异性连系。。在细胞凋亡的早期，，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外貌，，袒露在细胞外情形中。。将Annexin V 举行荧光素（FITC或PE）或Biotin 标记，，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，，使用流式细胞仪或荧鲜明微镜可检测细胞凋亡的爆发。。
　　7-AAD类似于碘化丙啶（propidine iodide，，PI）是一种核酸染料，，它不可透过完整的细胞膜，，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，，7-AAD能够透详尽胞膜而使细胞核红染。。因此将Annexin V 与7-AAD 匹配使用，，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区脱离来。。
　　目的： 通过慢病毒熏染获得过表达某基因的细胞株，，使用Annexin-PE和7-AAD双染法对正常细胞、比照组细胞、基因过表达组细胞的凋亡情形举行检测，，研究基因对细胞凋亡的影响。。
　　质料：质粒与细胞株
　　办法：细胞准备——网络细胞——Annexin-PE和 7-AAD举行双染色——流式上机检测

细胞侵袭和迁徙

　　在肿瘤生长历程中，，细胞进入循环系统的能力是主要的研究工具。。相关的信号通路主要可以分为控制细胞黏赞许控制细胞骨架。。细胞的迁徙与侵袭主要与细胞骨架和黏附相关。。肿瘤细胞侵袭和迁徙能力的改变通常接纳Transwell举行检测。。细胞划痕也是测定肿瘤细胞运动特征的要领，，由于无法区别正常增殖和迁徙细胞，，应用有局限性。。
　　
       Transwell实验
　　Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一样平常为聚碳酸酯膜），，将其安排于孔板中，，小室内称上室，，作育板内称下室。。由于聚碳酸酯膜有通透性，，下层作育液中的因素可以影响到上室内的细胞。。应用Transwell可研究下层作育液中的因素对细胞生长、运动等的影响。。
　　肿瘤迁徙实验：研究肿瘤细胞的迁徙能力或特定情形下肿瘤细胞的迁徙能力。。常用8.0、12.0µm膜，，上室种肿瘤细胞，，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，，肿瘤细胞会向营养因素高的下室跑，，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙能力。。
　　肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情形下肿瘤细胞的侵袭能力。。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，，模拟细胞外基质，，上室种肿瘤细胞，，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，，细胞要把基质消化后才可以从上室迁徙到下室，，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。。
　　目的： 研究目的基因过表达/滋扰对细胞侵袭、转移能力的影响
　　质料：正常细胞、比照慢病毒、过表达基因慢病毒
　　办法：细胞苏醒——Transwell铺板——细胞作育及染色——照相
　　
　　划痕实验原理
　　肿瘤细胞在体外仍具有迁徙的能力。。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特征的要领之一。。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模子，，在体外作育的单层细胞上，，划痕致伤，，然后较量差别实验组中肿瘤细胞迁徙的能力。。
　　目的： 使用筛选的稳固株（转比照病毒、过表达基因病毒），，通过对空细胞、比照稳转、目的基因稳转三组细胞举行划痕宽度举行统计学剖析，，研究基因对细胞迁徙能力的影响。。
　　质料：病毒和细胞株，，目的细胞泉源于客户，，稳固株UG环球构建
　　办法：细胞铺板——划线——细胞作育及照相——统计剖析
 
 
 

细胞周期检测

　　细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次破碎完成最先到下一次破碎竣事所履历的全历程，，分为间期与破碎期两个阶段。。细胞周期反应了细胞增殖速率，，单个细胞的周期测定可接纳缩时摄影的要领，，但它不可代表细胞群体的周期，，故现多接纳其他要领测群体周期。。
　　原理：
　　细胞周期各时相的DNA含量差别，，通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。。PI 即碘化丙锭，，可以与细胞内DNA 和RNA 连系，，接纳RNA酶将RNA消化后，，通过流式细胞术检测到的与DNA 连系的PI 的荧光强度直接反应了细胞内DNA含量的几多。。
　　因此，，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量举行检测时，，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期，，S 期和G2/M期，，并可通过特殊软件盘算各时相的百分率。。
　　目的： 通过慢病毒熏染获得基因过表达的细胞株，，使用PI染色法连系流式细胞术检测各组细胞周期的转变。。从而研究目的基因对细胞周期的影响。。
　　质料：目的细胞、病毒
　　办法：细胞准备——样品网络——上机检测——数据剖析

克隆形成实验

　　原理：单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），，其子女所形成的细胞群体，，称为集落或克隆。。每个克隆含有50个以上的细胞，，巨细在0.3 - 1.0mm之间。。细胞接种存活率只体现接种细胞后贴壁的细胞数，， 但贴壁后的细胞纷歧定每个都能增殖并形成克隆。。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。？？？寺⌒纬陕史从ο赴淖粤ι哪芰Φ那咳酰，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。。由于细胞生物学性状差别，，细胞克隆形成率差别也很大，，一样平常初代作育细胞克隆形成率弱，，传代细胞系强；；；；； 二倍体细胞克隆形成率弱，，转化细胞系强；；；；；正常细胞克隆形成率弱，，肿瘤细胞强。？？？寺⌒纬陕视虢又置芏扔幸欢ü叵担，做克隆形成率测准时，，接种细胞一定要疏散成单细胞悬液，，直接接种在作育皿中，，一连一周以上，，随时检查，，到细胞形成克隆时终止作育。。
　　目的：通过目的基因过表达/滋扰细胞组、空细胞组与阴性比照组(空病毒)克隆形成数目的统计学剖析，，研究基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。。
　　质料：病毒和细胞株
　　办法：铺板——细胞作育——视察克。。，染色，，盘算克隆形成率
　　

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