乳腺癌已成为全球癌症相关殒命的主要缘故原由，， ，，，也是女性最常见的癌症。。。。。。约莫20%的乳腺癌患者HER-2过表达，， ，，，因此预后较差。。。。。。现在，， ，，，靶向HER-2胞外区域的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗已是HER-2阳性乳腺癌的替换治疗计划。。。。。。然而，， ，，，只有一小部分转移性患者对曲妥珠单抗有反应，， ，，，约莫60%的患者在最初反应后爆发耐药性。。。。。。
外泌体是一种释放到组织液中且巨细为20-150nm的具膜小泡，， ，，，小泡中含有来自供体细胞的卵白质、脂质、编码和非编码RNAs，， ，，，这些分子可以被其他细胞所摄取。。。。。。有文献报道，， ，，，有些lncRNAs在乳腺癌曲妥珠单抗耐药历程中起主要作用。。。。。。然而，， ，，，外泌体包裹的lncRNAs是否加入了耐药作用尚不清晰，， ，，，需要进一步研究。。。。。。
克日，， ，，，海南省人民医院和郑州大学隶属第一医院配合在《Molecular Cancer》上揭晓论文，， ，，，叙述了外泌体lncRNA（AFAP1-AS1）可以与AUF1连系，， ，，，增进ERBB2翻译，， ，，，从而诱导曲妥珠单抗耐药。。。。。。
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实验效果：
1.LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中上调并被H3K27ac激
作者首先建设了乳腺癌的曲妥珠单抗耐药株（SKBR-3-TR和BT474-TR），， ，，，再将SKBR-3-TR和SKBR-3亲本细胞举行高通量测序，， ，，，凭证火山图、表达倍数转变等生物信息学剖析发明AFAP1-AS1在这两种类型细胞中显著失调。。。。。。随后，， ，，，作者用qRT-PCR验证了AFAP1-AS1在乳腺癌耐药细胞系中的水平，， ，，，效果显示，， ，，，与亲本细胞相比，， ，，，耐药细胞系中的AFAP1-AS1水平显著上调。。。。。。同时，， ，，，HER-2阳性乳腺癌组织中AFAP1-AS1水平比HER-2阴性乳腺癌组织也显着升高。。。。。。
随后作者通过表观遗传修饰实验发明在AFAP1-AS1启动子区域大宗富集组氨酸乙；；；℉3K27ac）。。。。。。别的，， ，，，曲妥珠单抗处置惩罚显著增添了亲代乳腺癌细胞H3k27ac的富集水平。。。。。。总之，， ，，，AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中泛起上调，， ，，，主要是由于在AFAP1-AS1启动子区域H3K27ac富集增添（Fig.1）。。。。。。
Fig.1 LncRNA AFAP1-AS1在曲妥珠单抗细胞中上调并被H3K27ac激活
2.滋扰lncRNA AFAP1-AS1可以逆转曲妥珠单抗的耐药性
作者对AFAP1-AS1举行滋扰后，， ，，，通过CCK8实验发明AFAP1-AS1敲低会显著增添曲妥珠单抗对细胞活力的抑制作用。。。。。。别的，， ，，，EdU染色和Transwell迁徙实验批注晰敲低AFAP1-AS1也显着降低了细胞增殖和镌汰细胞活力。。。。。。
随后作者进一步考察了AFAP1-AS1过表达对SKBR-3和BT474亲本细胞曲妥珠单抗的耐药性影响。。。。。。实验批注，， ，，，提高AFAP1-AS1可以消除曲妥珠单抗处置惩罚引起的细胞殒命，， ，，，别的，， ，，，AFAP1-AS1过表达可以增进细胞的增殖和迁徙能力（Fig.2）。。。。。。
Fig.2AFAP1-AS1敲低能逆转乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药性
3.LncRNA AFAP1-AS1水平与HER-2阳性乳腺癌患者的曲妥珠单抗耐药性相关
作者用qRT-PCR检测了64个HER-2阳性患者组织样本的AFAP1-AS1表达水平，， ，，，其中有32例曲妥珠单抗耐药患者和32例曲妥珠单抗反应患者。。。。。。效果批注，， ，，，曲妥珠单抗耐药患者中AFAP1-AS1水平比敏感患者显著上调。。。。。。作者发明，， ，，，无反应患者血清中的AFAP1-AS1水平比有反应患者的显着提高。。。。。。别的，， ，，，Kaplan-Meier剖析显示，， ，，，曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者在接受治疗前，， ，，，其血清内具有高水平AFAP1-AS1，， ，，，且与PFS和OS降低相关（Fig.3）。。。。。。
Fig.3高水平AFAP1-AS1与接受曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者的不良反应有关
4.胞外AFAP1-AS1通过装入外泌体中举行转达
作者用AFAP1-AS1探针举行FISH实验，， ，，，效果显示，， ，，，AFAP1-AS1主要漫衍在曲妥珠单抗耐药细胞的细胞质中，， ，，，这意味着AFAP1-AS1可能被包裹外泌体中举行渗透。。。。。。接着，， ，，，作者用RNAse和Triton×100处置惩罚细胞作育上清，， ，，，发明AFAP1-AS1释放时用膜包裹而不是直接释放。。。。。。随后，， ，，，作者疏散细胞作育上清中的外泌体，， ，，，通过TEM、NTA和WB实验举行判断，， ，，，批注疏散出的外泌体具有典范的膜状结构、直径巨细在30-150nm，， ，，，且卵白TSG101和CD81在外泌体中的大宗富集。。。。。。别的，， ，，，通过对细胞作育上清和外泌体中的AFAP1-AS1举行检测，， ，，，发明外泌体是胞外AFAP1-AS1渗透的主要载体。。。。。。同时，， ，，，作者视察到曲妥珠单抗耐药细胞的作育上清中AFAP1-AS1水平显着比敏感细胞高。。。。。。
为了相识AFAP1-AS1怎样包裹到外泌体中，， ，，，作者通过RIP实验发明了AFAP1-AS1与HNRNPA2B之间相互作用。。。。。。再将HNRNPA2B举行滋扰或过表达后，， ，，，AFAP1-AS1水平划分泛起降低或增高。。。。。。这些效果批注AFAP1-AS1以一种依赖HNRNPA2B1的方法被特异性包裹入外泌体(Fig.4)。。。。。。
Fig.4 胞外AFAP1-AS1通过包裹入外泌体举行转达
5.外泌体介导的AFAP1-AS1转达可撒播曲妥珠单抗耐药
作者从SKBR-3-TR细胞上清中疏散外泌体，， ，，，并用PKH26染料举行标记，， ，，，再与SKBR-3和BT474共孵育48h，， ，，，效果显示，， ，，，受体细胞有强烈的红色信号，， ，，，批注受体细胞能很好地吞噬外泌体。。。。。。随后，， ，，，提取受体细胞质中的RNA用qRT-PCR检测，， ，，，作者发明与外泌体共孵育后，， ，，，受体细胞中的AFAP1-AS1水平显著升高，， ，，，这说明晰外泌体中的AFAP1-AS1能够转达到受体细胞中。。。。。。
作者进一步研究了外泌体递送的AFAP1-AS1是否能同时将耐药表型转达给受体细胞。。。。。。实验效果显示，， ，，，用SKBR-3-TR泉源的外泌体孵育的亲本细胞对曲妥珠单抗的敏感性降低。。。。。。再用外泌体渗透抑制剂GW4869处置惩罚SKBR-3-TR细胞，， ，，，用处置惩罚后的SKBR-3-TR上清与亲本细胞共孵育，， ，，，发明上清没有将曲妥珠单抗耐药性转达给受体细胞。。。。。。同时，， ，，，敲低AFAP1-AS1和HNRNPA2B1能抑制共作育的亲本细胞获得曲妥珠单抗耐药的能力（Fig.5）。。。。。。
Fig.5外泌体介导的lncRNA AFAP1-AS1转移能诱导曲妥珠单抗耐药性
6.AFAP1-AS1通过上调HER-2表达诱导曲妥珠单抗耐药性
作者通过免疫荧光检测发明与亲本细胞相比，， ，，，HER-2卵白在SKBR-3-TR和BT474-TR细胞中是上调的。。。。。。在曲妥珠单抗耐药细胞中，， ，，，敲低AFAP1-AS1能降低HER-2表达，， ，，，可是用qRT-PCR检测ERBB2（ERBB2用于指示HER-2卵白的编码RNA）表达时，， ，，，发明AFAP1-AS1对ERBB2水平影响不显著。。。。。。别的，， ，，，过表达AFAP1-AS1能上调HER-2卵白水平而ERBB2水平不受影响。。。。。。总之，， ，，，作者证实了AFAP1-AS1在曲妥珠单抗耐药和HER-2表达上调中的作用，， ，，，然而，， ，，，AFAP1-AS1/HER-2信号轴是否加入了曲妥珠单抗耐药尚有待进一步证实（Fig.6）。。。。。。
Fig.6 乳腺癌细胞中lncRNA AFAP1-AS1能调理HER-2卵白水平
7.LncRNA AFAP1-AS1与AUF1连系施展要害作用
作者通过RNA-FISH和细胞分级PCR可以剖析出，， ，，，AFAP1-AS1主要漫衍在曲妥珠单抗耐药细胞的细胞质中，， ，，，这展现了AFAP1-AS1可能在转录后水平调理下游信号通路。。。。。。作者通过最小自由能（MFE）评估，， ，，，发明在911-1190nt位点的AFAP1-AS1转录本形成茎环结构，， ，，，这关于靶向RNA连系卵白的连系至关主要。。。。。。随后，， ，，，通过RNA pulldown实验作者判断出了AUF1卵白，， ，，，它能够连系到目的mRNA的3’非翻译区（UTR）并增进其翻译而不影响mRNA水平。。。。。。免疫荧光检测出AUF1和AFAP1-AS1在细胞质中共表达。。。。。。通过AFAP1-AS1探针设计和RNA pull-down实验，， ，，，作者发明AUF1卵白被AFAP1-AS1大宗富集。。。。。。别的，， ，，，RIP实验验证了AFAP1-AS1可由AUF1沉淀下来。。。。。。AUF1在转录和卵白水平上均不受AFAP1-AS1敲低的影响。。。。。。这些效果批注晰AFAP1-AS1能与AUF1卵白连系，， ，，，施展主要的生物功效（Fig.7）。。。。。。
Fig.7AFAP1-AS1与AUF1相互作用，， ，，，从而激活了ERBB2的翻译
8.敲低AFAP1-AS1可以逆转曲妥珠单抗耐药和体内转移
作者先将SKBR-3-TR和BT474-TR细胞熏染了sh-AFAP1-AS1或sh-NC，， ，，，构建了滋扰的稳固株，， ，，，再将稳固株皮下注射入裸鼠中，， ，，，形成滋扰的动物模子，， ，，，随后举行曲妥珠单抗腹腔治疗。。。。。。将20天后裸鼠中的肿瘤剥离并分成差别组，， ，，，效果显示，， ，，，sh-AFAP1-AS1组形成的肿瘤显着比比照组小。。。。。。通过IHC检测发明由sh-AFAP1-AS1熏染细胞形成的肿瘤，， ，，，其HER-2表达水平低于由比照组形成的肿瘤。。。。。。
作者将熏染了sh-AFAP1-AS1的SKBR-3-TR稳固株通过尾静脉注射入裸鼠中，， ，，，效果发明，， ，，，由sh-AFAP1-AS1稳固株爆发的萤光素酶计量和肺转移灶数显着少于由sh-NC细胞形成的肺转移灶数。。。。。。与正常肺组织相比，， ，，，HE染色肺组织转移灶阳性区域显着改善。。。。。。总之，， ，，，作者验证了滋扰AFAP1-AS1后可逆转妥珠单抗耐药性和乳腺癌的体内转移（Fig.8）
文章结论：
作者从曲妥珠单抗耐药株用lncRNA芯片筛选出高表达的lncRNA AFAP1-AS1，， ，，，再通过功效获得和缺失实验展现了敲低AFAP1-AS1能逆转曲妥珠单抗耐药性。。。。。。别的，， ，，，细胞外的AFAP1-AS1能与外泌体连系，， ，，，转达曲妥珠单抗耐药性。。。。。；；；粕，， ，，，AFAP1-AS1通过与AUF1连系提高ERBB2 mRNA的翻译，， ，，，从而诱导HER-2卵白水平的上调，， ，，，进而引起曲妥珠单抗耐药性（Fig.9）。。。。。。
Fig.9 曲妥珠单抗耐药转达的机制
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参考文献：
Mol Cancer. 2020; 19: 26. Exosome-mediated lncRNA AFAP1AS1 promotes trastuzumab resistance through binding with AUF1 and activating ERBB2 translation.
