慢病毒系列｜怎样巧妙使用病毒载体构建稳转株？？？快看过来！
基因表达调控是生物体内基因表达的调理控制 ，，，，，，在疾病研究领域 ，，，，，，基因表达调控险些是所有生物学历程的基础。。。。 。。细胞水平上对目的基因的导入方法凭证基因调控的时间是非可分为瞬时转染和稳固转染 ，，，，，，实验中多会选择稳转的方法构建稳固表达细胞株 ，，，，，，阻止瞬转效率差别以及瞬转细胞传代历程中目的基因丧失等缘故原由对实验造成误差。。。。 。。
01
稳固细胞株的构建要领
稳固转染原理：特定基因或滋扰特定基因的序列整合至宿主的基因组染色体中 ，，，，，，不会随着细胞的增殖破碎而消逝 ，，，，，，在宿主细胞中可以稳固表达目的序列。。。。 。。通常 ，，，，，，人们借助慢病毒能够整合序列到宿主基因组的能力来完成基因的稳固表达或稳固滋扰。。。。 。。
构建稳固株办法如下（以Saos-2细胞为例）：
1) 细胞铺板
将Saos-2细胞按30%汇合度接种到6孔板：
① Saos-2细胞配成2.0×105cells/mL细胞悬液 ，，，，，，待铺板。。。。 。。
② 每孔铺2mL ，，，，，，即4×105cells/well ，，，，，，铺1个6孔板。。。。 。。
2) 熏染慢病毒
细胞铺板后12-20h熏染病毒
① 加病毒量盘算要领：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）
②加polybrene：细胞样品中polybrene终浓度为5μg/mL。。。。 。。
③ 病毒熏染12-20h后换作育基：弃去作育基 ，，，，，，每孔加入2mL新鲜的作育基。。。。 。。
3) 稳固株筛选
① 72h以后 ，，，，，，加入终浓度2μg/mL puromycin。。。。 。。每隔2-3d换一次终浓度2μg/mL puromycin新鲜作育基。。。。 。。
② 药物筛选约两周后 ，，，，，，拍荧光照片。。。。 。。
③ 稳固细胞株判断和冻存。。。。 。。
注：其他细胞的polybrene浓度及抗生素浓度需要做预实验举行确定。。。。 。。
02
差别基因调控战略的选择
基因表达的调控可在多个层面上举行 ，，，，，，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控 ，，，，，，我们一样平常提及的基因调控多指基因及转录水平的上协调下调。。。。 。；；；虻纳系饔挚煞治庠垂泶锖湍谠葱约せ頒RISPRa（如表一） ，，，，，，当目的基因序列过长 ，，，，，，载体容量受限时多会选择内源性激活的方法实现目的基因上调。。。。 。。CRISPRa是使用CRISPR/Cas9系统 ，，，，，，突变Cas9卵白切割DNA的活性位点,使Cas9卵白损失切割DNA功效但依然保存与DNA连系的能力——称之为“d-Cas9” ，，，，，，d-Cas9毗连激活元件（VP64）通过gRNA指导至目的基因的转录起始位点 ，，，，，，便可实现目的基因的转录激活。。。。 。。
表一：外源过表达与内源性激活的区别
基因的下调一样平常都会接纳RNA滋扰（RNAi）手艺 ，，，，，，使用双链RNA（dsRNA）高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达。。。。 。。但RNAi手艺对靶基因的消除是不完全的 ，，，，，，若想完全消除需要借助CRISPR/Cas9手艺实现基因的敲除 ，，，，，，可凭证实验需求选择RNAi或是基因敲除（如表二）。。。。 。。
表二：基因默然两种方法较量
基因下调也可以选择内源性抑制CRISPRi战略 ，，，，，，与CRISPRa的原理相似 ，，，，，，“d-Cas9”与基因抑制结构域（KRAB结构域）融合表达 ，，，，，，通过gRNA的指导可实现目的基因的转录抑制。。。。 。。CRISPRi战略的优势在于可以不改变内源基因组序列、有较高水平的基因抑制效果、特异性更强且适用编码或非编码等多种类型的基因。。。。 。。
选择合适的基因调控战略 ，，，，，，借助慢病毒载体整合基因的能力 ，，，，，，快来构建稳转株吧！小编全心整理了UG环球客户应用差别调控基因战略的研究效果 ，，，，，，以期为科研人er提供新的研究思绪！
03
UG环球客户案例分享
1) 过表达＆滋扰
文章问题：Hypoxia-induced circRNF13 promotes the progression and glycolysis of pancreatic cancer
研究内容：糖酵解（胰腺癌）
揭晓期刊：Exp Mol Med. IF：12.153
细胞类型：SW-1990（过表达circRNF13）/MIA PaCa-2（滋扰circRNF13）
载体信息：pGLV31H1-Luci-circRNF13-OE/LV-shcircRNF13/LV-NC
克隆形成实验检测稳固过表达或稳固敲低circRNF13会正向调控PC细胞增殖(图A-D)。。。。 。。稳固细胞株构建肿瘤异种移植模子来验证circRNF13在体内的作用。。。。 。。效果显示 ，，，，，，circRNF13过表达显著加速肿瘤生长 ，，，，，，肿瘤体积和最终肿瘤重量显著增添(图E-H) ，，，，，，而circRNF13敲低组的肿瘤体积和重量低于比照组(图I-L)。。。。 。。皮下肿瘤组织的免疫组织效果批注 ，，，，，，Ki-67在circRNF13过表达肿瘤中的表达高于比照肿瘤(图M)。。。。 。。同时CD31（血管天生的生物标记物）阳性细胞在circRNF13过表达的肿瘤中的百分比高于比照肿瘤(图M)。。。。 。。在circRNF13敲低的肿瘤中的效果与之相反。。。。 。。为了进一步确定circRNF13在PC血管天生中的功效 ，，，，，，过表达circRNF13 SW-1990细胞的条件作育基增添了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的管形成。。。。 。。响应地 ，，，，，，敲低circRNF13 MIA PaCa-2细胞的条件作育基在很洪流平上损害了血管天生能力(图N)。。。。 。。综上所述 ，，，，，， circRNF13在PC增殖和血管天生中起主要作用。。。。 。。
图1. CircRNF13在体外和体内增进PC增殖和血管天生
2) 内源性激活
文章问题：PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation
研究内容：肿瘤爆发气制
揭晓期刊：Nat Cell Biol. IF：28.231
细胞类型：293T（内源性激活USP9X）
载体信息：LV-dCas9-Puro ，，，，，，LV-gRNA（USP9X/WDR5/PTEN3/PTENα/β）
对50例肝癌患者的肿瘤组织和响应的癌旁组织举行免疫印迹检测 ，，，，，，发明PTENα/β与PTEN卵白在肝癌中的表达纷歧致。。。。 。。与癌旁组织相比 ，，，，，，在一些PTEN镌汰的肿瘤组织中 ，，，，，，PTENα/β的表达坚持稳固 ，，，，，，甚至增添(图A ，，，，，，B)。。。。 。。PTENα和PTENβ对卵白酶体介导的降解较PTEN更敏感。。。。 。。研究通过优化电泳战略疏散PTENα和PTENβ ，，，，，，发明PTENα和PTENβ都比PTEN更不稳固(图C) ，，，，，，卵白酶体抑制剂MG132和PS341相较于溶酶体抑制剂NH4Cl或Brefeldin A显著积累了PTENα/β (图D)。。。。 。。Co-IP连系LC−MS/MS判断了3个E3毗连酶或去泛素化酶(USP9X、USP7和TRIM28) 和PTENα相互作用的卵白。。。。 。。通过滋扰（shRNA）或敲除（CRISPR-Cas9）手艺下调USP19在293T和Hela细胞中的表达会导致内源性PTENα/β的降低 ，，，，，，而不影响PTEN的表达（图E-G）。。。。 。。相反的是 ，，，，，，瞬时过表达USP9X和通过CRISPR-dCas9对USP9X举行的稳固转录激活均增添了293T细胞中的PTENα/β(图H,I) ，，，，，，但未增添PTEN卵白。。。。 。。综上 ，，，，，，USP9X正向调理PTENα/β ，，，，，，但不调理PTEN卵白的表达。。。。 。。
图2. PTENα和PTENβ在肝癌中的表达与PTEN卵白纷歧致 ，，，，，，且受USP9X的调控
3) 内源性抑制
文章问题：Human forebrain organoids-based multi-omics analyses reveal PCCB's regulation on GABAergic system contributing to schizophrenia
研究内容：精神破碎多组学剖析
揭晓期刊：Research Square.
细胞类型：hiPSCs（内源性抑制PCCB）
载体信息：pLV-hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro
PCCB编码丙酰辅酶a羧化酶的β亚基加入丙酰辅酶a28剖析代谢的线粒体酶 ，，，，，，PCCB突变可通过破损三羧酸(TCA)循环来损害线粒体能量代谢。。。。 。。用PCCB稳固敲低的hiPSCs或比照hiPSCs爆发的hFOs（Forebrain Organoid ，，，，，，大脑类器官）来研究敲低PCCB对功效的影响。。。。 。。效果显示 ，，，，，，在细胞氧化磷酸化中起作用的几个线粒体基因MT-ND2、MT-ND5和MT-CYB ，，，，，，在PCCB-G1和PCCB-G2 hFOs中均下调(图A)。。。。 。。同时 ，，，，，，PCCB敲低降低了hFOs中的ATP天生 ，，，，，，增添了ROS水平(图B,C) ，，，，，，引起线粒体功效障碍。。。。 。。ELISA实验证实PCCB敲低降低了琥珀酰辅酶a (SCOA)和α-KG(图D,E) ，，，，，，当在hFOs的作育基中添加可转化为GABA的上游代谢物α-KG (10 μg/ml) ，，，，，，发明在PCCB敲低的hFOs中GABA水平恢复(图F)。。。。 。。研究批注 ，，，，，，PCCB敲低通过镌汰TCA循环降低GABA水平(图G)。。。。 。。
图3. 敲低PCCB导致hFOs线粒体功效障碍
4) 单克隆敲除
文章问题：FBXO22 promotes leukemogenesis by targeting BACH1 in MLL-rearranged acute myeloid leukemia
研究内容：白血病
揭晓期刊：J Hematol Oncol. IF：23.168
细胞类型：THP-1人单核细胞白血病细胞（敲除FBXO22）
载体信息：pLenti-U6-gRNA-mCMV-SaCas9-P2A-sfGFP（gFBXO22）
为了研究Fbxo22缺陷抑制AML希望的分子机制 ，，，，，，通过免疫共沉淀(IP)连系LC-MS/MS剖析探讨了Fbxo22在THP-1细胞中的相互作用。。。。 。。关注到氧化应激反应的调理因子BACH1为THP-1细胞中与FBXO22相互作用卵白品貌最高的卵白(图A)。。。。 。。在THP-1细胞中可以检测到内源性BACH1与FBXO22的相互作用(图B,C)。。。。 。。THP-1细胞用CRISPR/Cas9敲除FBXO22后构建单克隆株 ，，，，，，发明BACH1的卵白水平显著升高；；；shRNA敲低FBXO22使THP-1和MV4-11细胞中的BACH1稳固；；；并证实BACH1卵白的增添与抑制BACH1的HO-1卵白的镌汰相关（图D-F）。。。。 。。与此相反的是在THP-1细胞中 ，，，，，，异位表达和诱导表达FBXO22显著降低BACH1卵白和/或增添HO-1的表达(图G, H)。。。。 。。别的 ，，，，，，放射线己酰亚胺(CHX)处置惩罚FBXO22敲除的THP-1细胞中BACH1卵白的降低被显著阻断(图I)。。。。 。。进一步验证FBXO22是否通过卵白酶体途径降解BACH1 ，，，，，，显示 ，，，，，，FBXO22的表达显著降低了BACH1卵白的表达 ，，，，，，而BFA和NH4Cl对该作用无显着影响 ，，，，，，这批注FBXO22介导的BACH1降解受到卵白酶体和CRL复合物调控（图L） ，，，，，，并且FBXO22增添内源性BACH1卵白的泛素连系物的品貌 ，，，，，，反之FBXO22敲除降低了THP-1细胞内源性BACH1泛素化(图M,N)。。。。 。。这些效果批注 ，，，，，，在MLLr AML细胞中 ，，，，，，FBXO22与BACH1相互作用并增进BACH1的降解。。。。 。。
图4. FBXO22在MLLr AML细胞中增进BACH1的降解
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