【on-target】AAV熏染肝脏 | 血清·启动子·注射手艺 | 一篇就GO了
?肝脏是脊椎动物消化系统中的一个器官 ， ，以代谢功效为主 ， ，并饰演着去毒素、氧化、肝糖原贮存、合身渗透性卵白等主要角色。。肝脏直接或间接地加入多个主要代谢途径 ， ，与多种遗传性疾病有关 ， ，现在已有几百种与肝脏相关的单基因疾病的报道。。因此 ， ，越来越多的科学家聚焦于借助先进手艺睁开对靶向肝脏的基因治疗。。
图1 肝脏结构（PMID: 32483353）
得益于病毒载体的生长 ， ，借助病毒载体举行靶向肝脏的基因水平或细胞水平操作已成为科学家研究热门。。
重组腺相关病毒载体（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）和腺病毒载体（Adenovirus）均能高效熏染肝脏组织。。其中腺病毒的强嗜肝性特点使其被普遍用于肝脏的研究中 ， ，相较于其他病毒载体 ， ，腺病毒载体具有容量大、快速表达、高效转导等优势 ， ，但腺病毒免疫原性强 ， ，熏染强烈 ， ，故常；嵋鸲锞植孔橹字⒎从突迕庖叻从 ， ，对动物体征和实验效果的客观性造成影响。。
rAAV载体是表达基因序列的理想载体 ， ，具有血清型种类多样、免疫原性低、恒久稳固表达基因、宿主规模广等优势 ， ，在基因功效研究和基因治疗递送载体中占有主导职位。。
01 rAAV载体血清型的选择
AAV2是第一个被报道用于体内基因递送的载体 ， ，其可以有用转导肝细胞。。随后 ， ，一些常用血清型（AAV8、AAV9、AAV5、AAV3、AAV-DJ）及AAVhu.37、AAVrh.8等AAV血清型载体被发明可以高效转导小鼠肝脏 ， ，其中AAV8血清型在小鼠肝脏的转导效率更高（有报道称通过静脉注射对肝脏的转导率为90%以上） ， ，且在肝脏中表达时间更长 ， ，别的 ， ，scAAV8可实现快速、高效、稳固、清静表达的目的。。尚有研究者发明 ， ，AAV8血清型体外转导人肝细胞效果较差。。研究者可凭证实验目的、实验设计去选择合适的病毒载体。。
图2 差别AAV血清型对肝脏转导率较量（PMID: 19861950）
熏染效果图
图3 UG环球生物测试AAV8血清型静脉注射熏染肝脏效果
UG环球生物可提供AAV1-9、AAV-DJ、AAVrh10等几十种AAV血清型病毒包装效劳。。
02 启动子选择
肝脏中细胞类型主要分为两类：实质细胞（parenchymal cells）和非实质细胞（nonparenchymal cells） ， ，其中 ， ，实质细胞约占肝脏体积的70-80%。。肝细胞（Hepatocyte）是肝脏中最主要的实质细胞 ， ，是肝脏基本功效单位—肝小叶的细胞组成 ， ，也是肝脏功效的主要肩负者 ， ，具有调理代谢、解毒的作用 ， ，加入卵白质合成及贮存、碳水化合物转换、胆汁的合成与渗透。。因此开发高效、特异靶向肝细胞的工具尤为主要。。现在 ， ，较为常用的肝细胞特异性启动子为：TBG和Alb。。别的 ， ，在肝脏组成中 ， ，还包括肝星状细胞（Hepatic stellate cells, HSCs ， ，也叫Ito细胞）、Kupffer细胞（ Kupffer cell, KC）和肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）等。。
表一 常用肝细胞特异性启动子
| 启动子 | 细胞特异性 | |
| TBG |
甲状腺素连系球卵白 （Thyroxin Binding Globulin） |
肝细胞 |
| Alb | 白卵白（Albumin） | 成年动物肝细胞（在发育中肝前体细胞中也有会表达） |
| CBh/CAG/CMV等 | 普遍熏染 | |
熏染效果图
图4 UG环球生物测试TBG和Alb启动子尾静脉注射熏染肝细胞效果
UG环球生物可提供CBh、CAG、CMV、EF1a等普遍表达启动子 ， ，亦可提供靶向肝细胞的TBG和Alb特异性启动子 ， ，资助您构建高效、特异性靶向肝脏的rAAV载体。。
03 注射方法及注射剂量
进入肝脏的血管有肝动脉和门静脉。。肝动脉发自腹腔动脉干运送富含氧气的血液；；门静脉引消化道（肠胃、胰腺、脾脏）的静脉血 ， ，运送富含消化营养的血液。。出肝脏的血液通过肝静脉 ， ，汇入后腔静脉。。
基于肝脏的结构特点 ， ，靶向肝脏的rAAV载体递送方法主要分为直接注射和系统注射。。
表二 靶向肝脏的rAAV载体递送方法
| 要领 | 优势 | 缺乏 | rAAV用量 | |
| 直接注射 |
肝叶直接注射 （direct injection into the liver lobes） |
高效转导、靶向性强 | 侵入性强、对操作有要求、手术危害大、对动物有危险。。 | — |
|
门静脉注射 （Portal vein injection, PV） |
1E+11vg | |||
|
脾被膜注射 （splenic capsule injection） |
— | |||
|
肝动脉注射 （Hepatic artery, HA） |
— | |||
| 系统注射 |
静脉注射 （intravenous, IV）：尾静脉注射和眶后静脉窦注射等 |
操作简朴 | 靶向性较直接注射差 ， ，可借助肝脏特异性启动子实现静脉注射特异性熏染肝脏。。 | 1-2E+11vg |
|
腹腔注射 （intraperitoneal, IP） |
约3E+11vg | |||
表中注射用量为：成年小鼠注射剂量。。
图5 靶向肝脏注射方法（PMID: 30783984）
注射操作视频请点击文末阅读原文
04 应用案例
借助rAAV2/8载体携带TBG启动子通过尾静脉注射可特异性熏染肝脏 ， ，实现对肝脏疾病的机制研究。。
图6 AAV8-TBG熏染肝脏（PMID: 35100024）
| 病毒产品 | AAV8-TBG-SIRT3, AAV8-TBG-NRF2 |
| 实验动物 | NRF2−/−小鼠 |
| 注射方法 | 尾静脉注射 |
| 熏染部位 | 肝脏 |
| 病毒用量 | 100 μL ， ，2E+11VG |
借助rAAV2/8载体举行肝脏的基因水平调控 ， ，在肝骨营养不良(HOD)的发病机制中发明了一个新的肝-骨轴 ， ，涉及肝脏PP2Acα的上调 ， ，导致肝因子卵磷脂-胆固醇酰；泼(LCAT)的表达镌汰 ， ，以及胆固醇从骨到肝脏的逆向转运缺陷。。（详情请点击【Cell Metab.】肝-骨轴缺陷增进肝性骨营养不良疾病的希望）
图7 AAV8熏染肝脏（PMID: 35235775）
| 病毒产品 | AAV8-Lcat ， ，AAV8-Lcat shRNA |
| 实验动物 | HOD鼠 |
| 注射方法 | 尾静脉注射 |
| 熏染部位 | 肝脏 |
| 病毒用量 | 2E+11VG |
参考文献
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[4] Methods Mol Biol. 2011;807:141-57. DOI: 10.1007/978-1-61779-370-7_6
[5] Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915. DOI: 10.3390/genes11080915
[6] Expert Opin Biol Ther. 2021 Jun;21(6):749-766. DOI: 10.1080/14712598.2021.1865303
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[8] Cell Metab. 2022 Mar 1;34(3):441-457.e7. DOI: 10.1016/j.cmet.2022.02.006
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