Cell Reports|投射特异性研究展现纹状体胆碱能神经元在帕金森中的作用
各人好， ，这里是只想咕咕的椰球。。。。。8月为各人带来的是一篇来自Cell Reports的研究。。。。。论文的问题很好地归纳综合了这篇研究的主要内容， ，抑制胆碱能中心神经元增强直接通路中等多棘神经元的皮层-纹状体突触传输从而改善帕金森综合征动物的运动学习。。。。。本文的作者均来自法国的艾克斯－马赛大学。。。。。
在之前的解读文章中， ，我们已经先容了细胞特异性（cell-type specific）研究在神经环路研究领域的基本思绪和手段（详细内容可回首往期文章：【Cell Reports】细胞特异性研究展现前岛叶皮层VIP中心神经元在顺应性行为中的作用）。。。。。通过遗传学等手段， ，细胞特异性研究可以针对性地关注某一群特征一致的神经元的运动纪律和心理功效。。。。。而本文的研究者所关注的是纹状体中胆碱能中心神经元对直接通路中等多棘神经元这一特异性投射在帕金森病中所施展的作用。。。。。因此可以以为本文的研究抵达了“投射特异性”水平。。。。。
在本文中， ，作者在离体（脑片）和在体两个层面， ，使用光遗传学、化学遗传学使用连系电心理、动物行为学等手艺展现了这条胆碱能投射通路对直接通路中等多棘神经元的突触转达和突触可塑性的调控作用， ，体现胆碱能系统对纹状体神经元的调控可能依赖于多巴胺输入的整合。。。。。
小序
本文涉及了纹状体中两类差别神经元：胆碱能中心神经元和中等多棘神经元。。。。。作为基底神经节的主要输入结构， ，纹状体中占绝对主导职位的是一类名为“中等多棘神经元（medium spiny neurons， ，MSNs）”的GABA能神经元。。。。。MSNs普遍接受来自于皮层、丘脑的谷氨酸输入以及来自黑质的多巴胺输入， ，并与基底神经节的输出结构相连加入运动控制（图 1左）。。。。。MSNs可以被分为两类：膜外貌表达Ⅰ型多巴胺受体的D1-MSNs直接投射向黑质网状部/内侧惨白球等基底神经节的输出结构， ，这条投射通路被称为直接通路（direct pathway）， ，本文中研究的直接通路MSNs就是这类细胞；；而表达Ⅱ型多巴胺受体的D2-MSNs则通过外侧惨白球、丘脑底核等核团与基底神经节的输出结构间接相连， ，因此被称为间接通路（indirect pathway）。。。。。多巴胺作用于D1-MSNs可以激活其运动但作用于D2-MSNs则会抑制间接通路的运动， ，直接通路和间接通路依赖于多巴胺调控的运动平衡被以为是基底神经节运动控制的主要基。。。。。ㄍ 1中）。。。。。在帕金森病中， ，由于黑质中多巴胺神经元大宗殒命， ，缺少多巴胺输入的两条通路运动逐渐失衡从而导致运动障碍的爆发（图 1右）。。。。。
图1 基底神经节环路和帕金森病的经典模子（McGregor and Nelson， ，2019）
除了MSNs外， ，纹状体中尚有少量的GABA能和胆碱能中心神经元。。。。。这两种中心神经元占比都不高（据预计只有1%-2%）， ，它们主要投射向局部的MSNs并对MSNs的运动起到调控作用。。。。。在本文中， ，研究者关注的是纹状体中的胆碱能中心神经元（cholinergic interneurons， ，CINs）， ，这类神经元因其以稳固的频率一连放电也被称为主要性发放神经元（tonically active neurons， ，TANs）。。。。。以往的研究显示， ，当夸奖或者运动事务泛起时CINs的主要性发放会泛起短暂的停留， ，研究者普遍以为CINs可以通过这种方法改变纹状体中乙酰胆碱的浓度从而在运动学习或决议中施展调控作用。。。。。然而在帕金森病中， ，CINs却失去了通过暂停调控神经运动的能力。。。。。本文作者之前的研究发明， ，使用光遗传手段在帕金森模子小鼠中抑制CINs运动可以选择性地影响皮层经直接通路诱发的黑质神经元反应， ，这提醒纹状体胆碱能神经元对直接通路MSNs的调控作用。。。。。然而， ，CINs向MSNs的胆碱能投射是怎样影响皮层-纹状体信息处置惩罚通路的， ，在帕金森病历程中这种调理作用又会爆发怎样的改变， ，依然值得进一步探索。。。。。
效果
为了在使用纹状体CINs运动的同时对D1-MSNs举行纪录， ，研究者首先建设了转基因工具鼠品系。。。。。使用Cre-loxp系统（关于Cre-loxp系统的应用可以参考文章：又见Cre！Cre/Loxp系统应用全攻略 | 知识点分享）， ，研究者将ChAT-cre与Rosa-NpHR鼠杂交从而在胆碱能神经元中特异性表达抑制性光敏卵白NpHR， ，然后再与D1-tdTomato鼠杂交从而使得D1-MSNs中特异性表达红色荧光。。。。。
在急性疏散的纹状体脑片中， ，研究者使用全细胞膜片钳方法钳制表达了红色荧光的D1-MSNs， ，并在皮层施加电刺激以诱发MSNs爆发突触后电位， ，同时使用585 nm光刺激以抑制CINs的运动（图 2A）。。。。。纪录效果批注， ，在非帕金森鼠的脑片中， ，光刺激未能显著改变D1-MSNs的兴奋性突触后电位（excitatory post-synaptic potentials， ，EPSPs）和配对脉冲比（paired-pulse ratio， ，PPR）（图 2B）。。。。。然而， ，在单侧注射6-OHDA诱导帕金森模子的工具鼠所制备的脑片中， ，光刺激时纪录到的诱发的EPSPs的幅度显著高于无光刺激， ，然而光照依然未使得PPR体现出显著转变（图 2C）。。。。。以上发明提醒当纹状体失去多巴胺支配后， ，短暂抑制CINs运动可以增强直接通路MSNs中皮层-纹状体的突触传输。。。。。
图2 6-OHDA模子动物中D1-MSNs皮层-纹状体EPSPs获得增强
光照导致EPSPs的幅度增强而PPR未爆发改变提醒了6-OHDA损伤可能对D1-MSNs突触后运动爆发了影响。。。。。因此研究者接下来检测了特异性表达在D1-MSNs膜上的M4代谢型乙酰胆碱受体（M4 mAChRs）是否加入了胆碱能神经元对MSNs的调控。。。。。使用M4 mAChRs的抑制剂托吡卡胺（tropicamide）孵育脑片， ，研究者发明D1-MSNs中的诱发EPSPs泛起了显著的上升（图 3A）。。。。。同样地， ，在托吡卡胺保存的条件下抑制CINs的运动并未对D1-MSNs的诱发EPSPs爆发显著影响（图 3B）， ，这提醒M4 mAChRs可能加入CINs对皮层-纹状体突触传输的调控。。。。。
下一步， ，研究者想到由于M4 mAChRs是一种G卵白偶联受体， ，激活Gαi偶联的M4 mAChRs将会抑制卵白激酶A（PKA）的运动。。。。。因此PKA途径可能加入了胆碱能神经元对MSNs的突触后调控。。。。。为了验证这一假说， ，研究者将PKA的抑制剂（PKI）加载在电极内液中导入D1-MSNs。。。。。在电极内液中保存PKI的条件下， ，EPSPs幅度并未因光抑制CINs而泛起上升（图 3C和3D）， ，提醒在帕金森模子鼠中， ，CINs通过M4 mAChRs及PKA途径调控皮层-纹状体的突触传输。。。。。
图3 在6-OHDA模子鼠中， ，M4 mAChR和PKA介导了D1-MSNs中光抑制CIN导致的皮层-纹状体EPSPs的上升
与此同时， ，研究者还提出了另外一个问题：为什么在6-OHDA模子鼠中， ，抑制CINs运动可以导致皮层-纹状体突出传输的改变， ，而在正常工具鼠中却检测不到这种改变？？6-OHDA注射可以杀死黑质中的多巴胺能神经元， ，从而扫除对MSNs和CINs的支配， ，这种改变是否影响了D1-MSNs膜外貌M4 mAChR的表达量或者M4 mAChR对乙酰胆碱的亲和力？？为了探索这个问题， ，作者划分使用流式荧光分选手艺（FACS-sorting）和G卵白激活的钾通道（GIRK2）对这两个问题举行了探索。。。。。效果显示6-OHDA模子鼠中的M4 mAChR的mRNA水平相比康健鼠虽然数值上略高于， ，但并没有统计上的区别（图 3E）。。。。。另外M4 mAChR关于内源乙酰胆碱的敏感性也未爆发显著的转变（图 3F）。。。。。因此6-OHDA注射所导致的转变卦有可能爆发在CINs而不是MSNs上。。。。。
以上效果在脑片上证实了在帕金森模子鼠中光抑制CIN运动可以调控皮层-纹状体的突触传输。。。。。接下来研究者希望通过在体水平的实验进一步验证这一征象。。。。。首先研究者构建了一套在体诱导MSNs爆发长时程增强（long-term potential, LTP）范式。。。。。依然接纳上文提到过的转基因工具鼠模子， ，使用在体胞内纪录手段， ，研究者对背侧纹状体（主要接受来自感受运动皮层输入）细胞举行了纪录。。。。。在膜电位的下降相， ，研究者对细胞注入去极化电流的同时使用短暂的高频电刺激以诱发LTP的爆发（图 4A）。。。。。另外， ，研究者还磨练了光刺激对CINs运动的抑制效果， ，效果批注光照可以强烈抑制纹状体CINs的放电， ，而在光照后CINs的运动泛起了大幅度的反弹（图 4B）。。。。。
验证范式建设后， ，研究者划分检测了未损伤、6-OHDA模子和6-OHDA模子+CIN抑制三种情形下MSNs的LTP诱发情形。。。。。在未损伤状态下， ，高频电刺激后EPSP斜率随时间体现出显着的上升趋势， ，提醒LTP被乐成诱发（图 4C， ，灰色）。。。。。而在6-OHDA帕金森模子动物中， ，EPSP斜率完全不随时间转变， ，批注在帕金森模子动物中皮层-纹状体的突触可塑性遭到破损（图 4C， ，绿色）。。。。。最后， ，在6-OHDA模子动物中使用光抑制CIN运动使得EPSP斜率泛起了小幅上升， ，虽然缺乏未损伤动物的水平， ，可是显著高于无光刺激的模子动物（图 4C， ，黄色）。。。。。以上效果批注， ，光抑制CINs运动可以部分恢复帕金森动物中的LTP作用。。。。。
图4 在帕金森模子鼠中光抑制CIN运动可以部分恢复皮层-纹状体的在体长时程增强作用
在本文的最后， ，研究者磨练了抑制纹状体CINs运动对动物行为表型的改变。。。。。作为一个高水平的研究， ，从细胞层面太过到行为层面从而形成研究条理的完整是必需的。。。。。为了磨练抑制CIN对动物运动能力的影响， ，研究者使用加速转棒（Rota-Rod）实验作为运动技巧学习的范式， ，并且接纳化学遗传的方法对CINs的运动举行了使用。。。。。首先研究者照旧在电心理水平验证了化学遗传抑制的效果。。。。。在ChAT-cre鼠的纹状体注射cre依赖的受体hM4Di（巧合的是hM4Di正是从乙酰胆碱受体上刷新而来）， ，给予CNO后研究者发明CINs的放电频率泛起了显著的下降， ，并且可以维持30 min以上（图 5B）。。。。。接下来， ，作者划分在6-OHDA模子动物的纹状体注射携带了hM4Di或空载的AAV病毒， ，未损伤的sham动物也在纹状体注射了含空载体的AAV病毒作为比照（图 5C）。。。。。研究者对这三组动物举行了转棒实验的训练和测试， ，效果不出意外， ，注射了比照病毒的6-OHDA模子动物从转棒上跌落的速率最快， ，体现出最短的掉棒潜在期（latency to fall）。。。。。而未损伤动物则体现出最长的掉棒潜在期， ，虽然只有150 s（图5D， ，灰色）。。。。。而在转棒测试前给予CNO化学遗传抑制CINs运动使得动物的掉棒潜在期显著高于6-OHDA模子鼠（图5D， ，黄色）。。。。。以上效果批注抑制CINs运动可以改善帕金森模子鼠的运动学习能力， ，这与上文电心理纪录的效果是一致的。。。。。
图5 在6-OHDA诱导的帕金森模子动物中使用化学遗传抑制CINs运动可以增强动物的运动技巧学习能力
尾声
本文虽然篇幅不长（只有四个figure）， ，可是基本遵照了我们之前所提到的环路研究思绪（由于是投射特异性研究， ，本文不需要示踪实验， ，可是纪录和使用实验贯串始终）， ，内容扎实， ，从细胞到行为水平一应俱全。。。。。尤其是研究者在脑片和在体研究中所接纳的范式难度不小， ，体现出了研究者高明的电心理功底。。。。。虽然不可否定的是， ，作者在主要研究内容中依然未能解答6-OHDA损伤是怎样改变纹状体CINs-MSNs环路从而导致调控模式爆发转变的这一问题。。。。。虽然我们可以推测这一改变与多巴胺系统的缺失有着千丝万缕的联系， ，可是其详细路径依然很是值得关注。。。。。
[1] McGregor M M, Nelson A B. Circuit mechanisms of Parkinson’s disease[J]. Neuron, 2019, 101(6): 1042-1056.
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