论文问题：Induction of m6A methylation in adipocyte exosomal LncRNAs mediates myeloma drug resistance
刊登日期：2022年01月
揭晓杂志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影响因子：12.658
研究机构：休斯顿卫理公会癌症中心 ，，，，，休斯顿卫理公会研究所 ，，，，，厦门大学医学院癌症研究中心 ，，，，，德克萨斯大学安德森癌症中心血液学系
手艺手段：m6A测序、联川生物OmicStudio云平台
文章架构
主要研究内容
1、来自MM患者脂肪细胞的外泌体对化疗诱导的MM细胞凋亡具有保 ；； ；；ぷ饔
图1
该研究首先从正常骨髓（NADs）和多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓（PtADs）中疏散出脂肪细胞 ，，，，，使用透射电镜视察到从脂肪细胞作育液上清中网络到的外泌体呈杯状。。随后将MM细胞与外泌体共作育 ，，，，，使用共聚焦显微镜发明被标记上Dil的外泌体保存于MM细胞的细胞膜上 ，，，，，并在胞浆内移动 ，，，，，批注脂肪细胞外泌体能够被MM细胞吸收。。 该研究还发明NADs和PtADs的外泌体均能抑制化疗药物bortezomib(BTZ)诱导的MM细胞凋亡 ，，，，，其中PtADs外泌体的抑制作用更显着。。说明脂肪细胞外泌体对MM耐药性具有潜在影响。。
图2
将几种MM细胞系及对应化疗药物与MM相关脂肪细胞（MMADs）中的外泌体共作育 ，，，，，NADs外泌体作为比照。。效果发明 ，，，，，与NADs相比 ，，，，，MMDAs外泌体显著降低了化疗药物的治疗效果。。批注MM细胞可能增强脂肪细胞外泌体对MM细胞化疗耐药性的影响。。
2、脂肪细胞外泌体携带的lncRNAs抑制MM细胞凋亡
图3
与NADs外泌体的lncRNAs相比 ，，，，，MMADs外泌体的lncRNAs（LOC606724和SNHG1）显著上调。。使用MMRF CoMMpass RNA-seq数据库剖析 ，，，，，发明LOC606724和SNHG1的表达与患者总生涯期呈显著正相关。。并且在MM细胞中过表达或敲除这两个lncRNAs可划分抑制或增强化疗药物的疗效。。批注MMADs外泌体携带的lncRNAs对化疗诱导的MM细胞凋亡具有保 ；； ；；ぷ饔。。
图4
SNHG1已被证实加入调控肿瘤生长 ，，，，，作者后续对LOC606724怎样调控MM细胞凋亡举行了研究。。发明过表达或敲除脂肪细胞中的LOC606724可划分使MMADs中的癌卵白c-Myc显著上调或下调 ，，，，，但不影响c-Myc mRNAs表达。。批注LOC606724在转录后水平上调MM细胞中的c-Myc卵白。。
elF4E是卵白翻译中的要害分子 ，，，，，通过RIP检测 ，，，，，发明c-Myc卵白可与elF4E卵白连系 ，，，，，并显著富集于过表达LOC606724的MM细胞 ，，，，，而过表达c-Myc可抑制化疗药物的疗效。。批注LOC606724通过连系elF4E加入介导c-Myc卵白合成。。
3、MM细胞增进IncRNA向脂肪细胞外泌体富集
图5
通太过析NADs和MMADs在细胞或外泌体中lncRNAs的表达水平 ，，，，，发明外泌体中的lncRNAs显著上调 ，，，，，并且MMADs外泌体中的lncRNAs水平显着高于NADs。。使用RNA pull-down实验检测到lncRNAs包装至外泌体中所需的RNA连系卵白（hnRNPA2B1和hnRNPU）。。使用这两个卵白的抗体举行RIP实验 ，，，，，发明lncRNAs在MMADs中显著富集。。使用siRNAs下调MMADs中的这两个卵白后 ，，，，，可使MMADs外泌体中的lncRNAs下调 ，，，，，并诱导更多的MM细胞凋亡。。这些效果批注 ，，，，，MM细胞可增进脂肪细胞中与RNA连系卵白连系的lncRNAs被包装到外泌体中。。
4、脂肪细胞中METTL7A介导的lncRNAs m6A甲基化的判断
图6
使用MeRIP-seq对脂肪细胞举行研究 ，，，，，与NADs相比 ，，，，，MMADs中保存lncRNAs的甲基化。。然后通过lncRNAs pull-down实验 ，，，，，发明MMADs裂解物中保存METTL7A。。RIP实验进一步证实LOC606724富集于METTL7A。。 随后作者通过构建和纯化His标记的重组METTL7A融合卵白 ，，，，，举行了体外甲基转移酶活性剖析 ，，，，，证实METTL7A具有m6A甲基转移酶活性 ，，，，，并且酶活性主要来自于METTL7A卵白76-172 AA。。然后作者使用SRAMP软件发明LOC606724上保存七个潜在的m6A motifs ，，，，，并通过体外甲基化剖析发明METTL7A卵白可增添含有M5基序的RNA寡核苷酸的m6A水平。。其中M5基序位于LOC606724的481nt处并含有AMP ，，，，，当将这个AMP变为GMP后 ，，，，，m6A酶活性显着降低。。这批注METTL7A卵白的76-172AA与LOC606724的第481位AMP甲基化有关。。
下一步 ，，，，，作者构建了MMADs的METTL7A默然表达载体（siMETTL7A） ，，，，，通过m6A-RIP实验 ，，，，，发明MMADs中的m6A水平显著降低 ，，，，，lncRNAs对RNA连系卵白的富集度下降 ，，，，，并导致外泌体lncRNAs显著下调。。将MM细胞与siMETTL7A-MMADs的外泌体共作育后 ，，，，，MM细胞凋亡率显着提高。。这些效果批注 ，，，，，具有甲基化转移酶活性的METTL7A有助于lncRNAs的m6A甲基化 ，，，，，甲基化的lncRNAs可以富集在脂肪细胞外泌体中。。
5、MM细胞通过EZH2介导的卵白质甲基化增强脂肪细胞的METTL7A活性
图7
通过使用抗METTL7A抗体拉下脂肪细胞裂解物 ，，，，，检测到MMADs免疫沉淀物中的METTL7A卵白甲基化水平高于NADs的免疫沉淀物 ，，，，，批注MM细胞增强了METTL7A卵白的甲基化。。 EZH2是一种赖氨酸甲基转移酶 ，，，，，可以使组卵白和非组卵白甲基化。。EZH2在MMADs中的表达水平高于NADs。。作者构建的EZH2默然载体（siEZH2）可使MMADs中的METTL7A卵白甲基化水平以及lncRNAs表达水平降低 ，，，，，并使化疗药物治疗后的MM细胞凋亡率显着提升。。批注EZH2能够增强脂肪细胞中METTL7A活性 ，，，，，从而增进lncRNAs甲基化 ，，，，，镌汰化疗后MM细胞的凋亡率 ，，，，，最终增强MM细胞的耐药性。。
图8
接着作者构建了PDX模子 ，，，，，注射靶向药（bortezomib或tazemetostat）两周后 ，，，，，发明小鼠骨髓瘤显着缩小 ，，，，，并降低了脂肪细胞外泌体中lncRNAs的表达。。构建EZH2敲除的MM小鼠模子后 ，，，，，发明靶向药治疗效果变得更好 ，，，，，并提高了小鼠生涯率 ，，，，，而脂肪细胞中的METTL7A甲基化水平降低。。批注脂肪细胞EZH2对MM细胞化疗具有潜在作用。。
总之 ，，，，，该研究通过体外和体内实验 ，，，，，发明MM患者脂肪细胞中网络的外泌体及其中的lncRNAs (LOC606724和SNHG1)均可抑制化疗诱导的MM细胞凋亡 ，，，，，即增强了骨髓瘤细胞的耐药性。。通过RIP、MERIP-seq和RNA-Protein pull-down实验发明lncRNAs可以与METTL7A卵白互作 ，，，，，同时证实了METTL7A具有RNA甲基转移酶活性； ；； ；；最后研究批注MM细胞通过EZH2介导的METTL7A卵白甲基化增强了METTL7A活性 ，，，，，从而增进lncRNAs包装到脂肪细胞外泌体中。。该研究指出了一种通过阻断外泌体介导的肿瘤恶性循环来提高癌症治疗效果的潜在战略。。
