2022年5月的春风掠面而过，，，，不知不觉中深埋在口罩里的高材生们，，，，就到了一年的结业季，，，，此时许多应届结业的硕博都忙着写文章投文章，，，，搞的焦头烂额，，，，想要在结业前的一点时间里做出属于自己的学术效果。。。。。。然而也有一些人，，，，早早就拿到了文章吸收函，，，，此时正在跟自己的朱颜知己享受校园青春中最纯粹的一段快乐时光。。。。。。是由于实验不起劲么？？？？？？是由于科研的敏感性差么？？？？？？着实都不是的，，，，在我看来，，，，最大的缘故原由在于不相识肿瘤偏向发文章的“套路”。。。。。。
为相识决这个问题，，，，微风在这里选择2022年5月揭晓在《CANCER GENE THERAPY》杂志，，，，题为“CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells”的文章[1]，，，，与各人一起配合品味肿瘤研究中的“套路”。。。。。。
01 配景先容
肝母细胞瘤是一种具有多种分解方法的恶性胚胎性肿瘤。。。。。。它是由胎儿性上皮性肝母细胞，，，，胚胎性细胞以及分解的间叶因素组成，，，，这种疾病多爆发于小儿。。。。。。关于此类肿瘤，，，，手术切除是最为有用的治疗要领，，，，若是肿瘤是单发的、瘤体较小、位置表浅且无肝外转移，，，，手术切除可获治愈。。。。。。可是凌驾半数的患者在就诊的时间就失去了手术时机。。。。。。并且肝母细胞瘤对放疗和化疗均不敏感，，，，因此找寻致病历程中的要害基因，，，，战胜现有治疗方法的瓶颈显得至关主要。。。。。。
CRISPR/Cas9单克隆敲除株，，，，是使用单链导向RNA通过碱基互补配对的原理靶向基因的连系位点，，，，随后Cas9核酸内切酶连系到与单链导向RNA形成双链的基因区域举行切割。。。。。。切割形成的双链DNA断裂在细胞内被修复，，，，造成基因敲除的主要修复机制是非同源最后毗连NHEJ，，，，这种修复将爆发短的核酸插入或者删除从而导致基因移码突变。。。。。。现在构建单克隆细胞株的方法主要有电转Cas9卵白和gRNA、瞬转Cas9-gRNA质粒、慢病毒侵染、转座子构建 4种方法，，，，现在主流的敲除株效劳公司和高校及研究所的各个课题组，，，，主要使用的是前3种要领。。。。。。
图1.CRISPR/Cas9敲除原理[2]
02 手艺思绪
（1）使用CRISPR/Cas9敲除手艺构建HuH6细胞PIM6敲除单克隆细胞系，，，，体外检测增殖、周期、凋亡、迁徙、侵袭等通例功效学。。。。。。
（2）使用古板的RNA-seq手艺，，，，确定PIM3敲除后下游信号通路的转变。。。。。。
（3）使用过表达质粒，，，，扭转PIM3敲除，，，，举行细胞功效学检测。。。。。。
（4）验证PIM3敲除后，，，，关于HuH6细胞干性的影响。。。。。。
（5）体内实验验证PIM3敲除关于HuH6细胞皮下增殖能力的影响。。。。。。
03 研究内容
作者首先通过瞬转Cas9和gRNA表达载体的方法，，，，构建了HuH6 PIM3KO单克隆细胞株。。。。。。并通过Western Blot判断敲除细胞株的PIM3表达，，，，选择B11、D2、E8 3个敲除单克隆举行后续功效研究。。。。。。作者划分使用了CTG法检测细胞增殖、台盼蓝法检测细胞存活、transwell法检测细胞的迁徙和侵袭能力、流式检测了细胞的周期转变。。。。。。
图2.PIM3细胞功效检测
作者通过转录组测序的方法，，，，发明PIM3KO后，，，，共有746个基因爆发了显著性表达改变，，，，其中378个差别基因上调，，，，368个差别基因下调。。。。。。通过IPA剖析，，，，PIM3KO显着泛起了细胞殒命和分解基因的上调。。。。。。其中CCR5信号通路是下调最为显着的，，，，而此通路已经明确证实可诱导癌细胞归巢到转移部位来增进肿瘤希望。。。。。。除此之外，，，，发明了一些细胞分解通路的激活，，，，如FXR/RXR和LXR/RXR，，，，这也证实晰PIM3具有调理肝母细胞瘤去分解的功效。。。。。。
图3.转录组测序效果
作者使用过表达载体，，，，在PIM3KO的细胞中做了回复，，，，发明回复PIM3基因表达后，，，，细胞增殖速率显着增添，，，，而迁徙和侵袭能力也显着获得了回复，，，，证实PIM3的功效是真实可信的。。。。。。
图4.回复实验
由于在转录组测序的效果中发明PIM3基因与细胞去分解有关，，，，因此作者想验证一下PIM3基因与肿瘤干性的关系，，，，首先文章判断了干性最通例的指标CD133并通过成球实验证实PIM3KO后显着降低HuH6细胞干性。。。。。。同时也测定了其他干性的biomarker，，，，例如Oct4、Nanog、Sox2、Nestin，，，，证实了PIM3确实影响肿瘤干性。。。。。。
图5.PIM3基因影响肿瘤干性
至此，，，，作者完成了所有体外实验，，，，可是由于文章完整性的要求，，，，又举行了体内实验的检测。。。。。。首先构建了皮下移植瘤模子，，，，丈量了生长曲线和生涯曲线，，，，并用免疫组化检测了KI67的表达，，，，确定了PIM3KO后，，，，会影响肿瘤的在体增殖。。。。。。
图6.PIM3基因功效在体验证
总结一下，，，，通篇文章只是证实晰PIM3在肝母细胞瘤中的作用和机制这件很简朴的事情，，，，就揭晓了影响因子在6分左右的文章。。。。。。它值得学习的地方在于设计的套路，，，，使用单克隆敲除株探索基因功效，，，，使用测序掘客通路差别，，，，最后再举行通路检测和回复实验，，，，套路化显着，，，，思绪直白清晰，，，，很是合适硕士博士们模拟，，，，快速揭晓文章。。。。。。
参考文献
[1]Raoud Marayati, Laura L. Stafman et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells.Cancer Gene Ther. 2022 May ; 29(5): 558–572. doi:10.1038/s41417-021-00334-4.
[2]TianzuoZhan,NiklasRindtorff et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy.Seminars in Cancer Biology Volume 55, April 2019, Pages 106-119，，，，doi：org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001.
