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【Insights】都能产出rAAV，，，Sf9昆虫细胞系统和人293细胞系统哪个更好？？？ ？？

时间：2022-03-25 热度：
 
重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)是一种对人体无致病性的单链DNA病毒，，，具有免疫原性低，，，转导效率高，，，且不可自我复制的特点，，，可实现体内和体外高效基因递送。。。。。现在，，，多款基于rAAV的基因治疗产品已经获批上市，，，并取得了优异的疗效，，，rAAV也成为基因治疗行业最为炙手可热的明星产品。。。。。
 
 
 

那么，，，能够高效、清静递送基因的rAAV是怎样被生产出来呢？？？ ？？当下主流的生产系统有两种，，，一是使用经典的三质粒包装系统，，，瞬时转染人293细胞爆发病毒；；；；另一种即使用携带rAAV载体基因组、Rep卵白和Cap卵白的杆状病毒熏染Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫细胞，，，从而爆发rAAV病毒。。。。。这两种生产系统有何差别？？？ ？？实验和临床应用时，，，哪种效果更好？？？ ？？

 

基于293细胞的rAAV包装系统

三质粒转染人293细胞是实验室及制药工业领域最常用的rAAV生产要领之一，，，该系统最经典的生产工艺主要是同时使用穿梭质粒（含有目的基因表达框）、包装质粒（含AAV复制功效的Rep卵白与衣壳卵白Cap表达框）与辅助质粒（含有腺病毒的主要元件，，，加入病毒颗粒增殖）同时转染293细胞，，，从而获得rAAV病毒颗粒。。。。。美国FDA批准的Zolgensma、Luxturna两款rAAV基因治疗产品，，，均是使用了三质粒转染人293细胞的生产系统。。。。。
 
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图1 三质粒转染293细胞生产rAAV

图片泉源：Mueller C et al., Curr Protoc Microbiol. 2012

 

Sf9包装系统

Baculovirus/Sf9是一种替换哺乳动物细胞系的rAAV生产计划，，，该系统使用杆状病毒表达载体（Baculovirus expression vectors, BEVs）熏染Sf9昆虫细胞来生产rAAV病毒颗粒。。。。。借助Sf9细胞可以大宗表达重组卵白的特点，，，该系统使用含有rAAV基因组以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆虫杆状病毒转导Sf9细胞，，，使rAAV在Sf9细胞中组装，，，最终抵达大规模生产rAAV的目的。。。。。

 

由于Sf9昆虫细胞可以在大规模反应器中高密度悬浮作育，，，因此该系统更容易放大规模；；；；同时，，，杆状病毒关于哺乳动物和植物是非致病性的，，，且接纳无血清作育系统，，，相较依赖质粒转染的293细胞生产系统更为清静。。。。。2012年，，，欧洲药品治理局（EMA）批准的首个rAAV基因治疗药物Glybera正是使用Sf9昆虫细胞生产系统生产的rAAV病毒颗粒。。。。。

 

293细胞包装系统与Sf9包装系统的差别

只管在已往的10年里，，，羁系部分陆续批准若干基于AAV的基因治疗产品，，，但该领域仍面临多项挑战，，，例如rAAV的产量、质量、免疫原性等。。。。。2020年9月，，，Neil G. Rumachik等人在Mol Ther Methods Clin Dev.揭晓的事情就对293细胞与Sf9细胞的rAAV生产系统差别做了剖析。。。。。该事情发明，，，差别主要集中在生产历程中爆发的杂质、衣壳卵白翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs)和体内/体外的熏染效率（图2）

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图2 Sf9细胞包装系统与293细胞包装系统生产的rAAV差别

图片泉源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

文中明确指出：

1）差别的包装系统生产的rAAV病毒颗粒衣壳具有差别的PTMs，，，包括糖基化、乙；；；；⒘姿峄图谆ㄍ3）；；；；

2）两个包装系统包装历程中，，，rAAV基因组均爆发甲基化，，，但两套系统似乎对基因组爆发了相反的作用，，，Sf9细胞生产系统产出的rAAV趋向抑制基因表达，，，293细胞生产的rAAV泛起趋向激活基因表达；；；；

 

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图3 293细胞和sf9细胞平台生产的rAAV衣壳修饰差别

图片泉源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

3）差别系统生产的rAAV的空壳率及杂质也有所差别，，，293细胞生产的rAAV病毒空壳率显著更低（图3），，，爆发的杂质与包装历程爆发的核酸和卵白质相关；；；；而Sf9细胞系统空壳率相对较高，，，杂质与内肽酶活性和卵白质水解有关，，，别的，，，杆状病毒系统爆发的杂质要么是结构性的，，，要么是与病毒逃逸有关。。。。。

4）另外，，，293细胞生产的rAAV展现出更强的体内及体外熏染能力，，，研究发明无论是在体内照旧体外实验，，，无论是通过肌肉注射照旧通过尾静脉系统给药注射，，，293细胞生产的rAAV都具有更好的熏染能力（图4）。。。。。

 

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图4 差别生产系统生产的rAAV在体外及骨骼肌中的熏染能力差别

图片泉源：Neil G. Rumachik et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2020

 

因此，，，从这些数据展示可以看到，，，基于293细胞生产的rAAV可能比Sf9有更好的熏染效率、更高的质量，，，也更有临床应用的潜力。。。。。虽然，，，不可否定的是，，，Sf9系统rAAV包装系统具有更高的rAAV包装产率，，，假以时日，，，解决上述问题的Sf9包装系统亦有潜力成为基因治疗载体生产的主要实力。。。。。

 

UG环球生物拥有授权清晰的HEK293细胞系，，，可对基于该细胞的rAAV生产系统开展优化及刷新，，，开发更好的rAAV生产系统。。。。。同时，，，UG环球生物使用自有的GMP级病毒包装质粒用于研究级rAAV病毒载体的生产，，，不计本钱，，，全力镌汰批次间差别、杂质及污染，，，让基因递送触手可及！

 

 

 

 
 
 
 

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参考文献

[1] Rumachik NG, Malaker SA, Poweleit N, Maynard LH, Adams CM, Leib RD, Cirolia G, Thomas D, Stamnes S, Holt K, Sinn P, May AP, Paulk NK. Methods Matter: Standard Production Platforms for Recombinant AAV Produce Chemically and Functionally Distinct Vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 May 22;18:98-118. doi: 10.1016/j.omtm.2020.05.018. PMID: 32995354; PMCID: PMC7488757.
[2] Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019 May;18(5):358-378. doi: 10.1038/s41573-019-0012-9. PMID: 30710128; PMCID: PMC6927556.
[3] Bulcha JT, Wang Y, Ma H, Tai PWL, Gao G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 2021 Feb 8;6(1):53. doi: 10.1038/s41392-021-00487-6. PMID: 33558455; PMCID: PMC7868676.
[4] Mueller C, Ratner D, Zhong L, Esteves-Sena M, Gao G. Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Microbiol. 2012 Aug;Chapter 14:Unit14D.1. doi: 10.1002/9780471729259.mc14d01s26. PMID: 22875565; PMCID: PMC4358842.
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