突破：山东大学脑科学团队李新钢＆王剑团队展现抑制GBM历程的新机制
Pre-mRNA剪接是转录后的一个历程，，，，， ，可由单个基因爆发多个mRNA亚型。。。 。。由于mRNA决议了卵白质的序列和功效，，，，， ，剪接历程有可能扩大编码卵白质的种类。。。 。。Pre-mRNA的表达受转录调控，，，，， ，特定mRNA的相对品貌取决于剪接情形。。。 。。RNA测序批注，，，，， ，凌驾90%的人类编码卵白质的基因会通过pre-mRNA剪接去除内含子，，，，， ，内含子保存是一种常见的异常剪接类型。。。 。。已有研究证实具有剪接功效的某些RNA连系卵白（RBP)失调会增进癌症的爆发和生长。。。 。。
NONO，，，，， ，是一种非POU结构域的八聚体连系卵白，，，，， ，属于DBHS卵白家族。。。 。。与许多RBP相似，，，，， ，NONO通过多种机制施展其多种功效，，，，， ，加入差别的心理和病理历程。。。 。。例如，，，，， ，NONO加入cGAS介导的先天免疫激活，，，，， ，在免疫通路中直接连系病毒衣壳，，，，， ，修复DNA损伤以及维持端粒稳态。。。 。。别的，，，，， ，NONO在转录和转录后差别阶段的调控是至关主要的。。。 。。NONO还协调代谢基因pre-mRNA的加工，，，，， ，尤其是内含子的去除。。。 。。
然而，，，，， ，NONO的功效在RNA剪接和癌症的爆发生长中还需要进一步的叙述，，，，， ，特殊是在GBM中，，，，， ，这是迄今尚不明确的。。。 。。癌细胞转录的太过激活导致需要处置惩罚的pre-mRNA增添，，，，， ，并且最近的研究报道了许多影响癌症希望的异常剪接事务。。。 。。因此，，，，， ，剪接因子是未来癌症治疗的潜在治疗靶点，，，，， ，包括胶质母细胞瘤(GBM)的治疗。。。 。。然而，，，，， ，在GBM中内含子剪接异常的保存机制尚不明确。。。 。。
近期，，，，， ，山东大学李新钢和王剑教授的脑科学团队在Theranostics杂志上揭晓题为Targeting the splicing factor NONO inhibits GBM progression through GPX1 intron retention的文章，，，，， ，研究展现了剪接因子NONO在GBM希望中的作用，，，，， ，以及靶向剪接因子来治疗GBM的可能性。。。 。。
效果
01 剪接因子NONO在GBM中高表达
研究者通过果真的TCGA数据库，，，，， ，在具有mRNA剪接功效的355个卵白中锁定治疗GBM的潜在靶点剪接因子NONO。。。 。。NONO在GBM中表达显著高于正常脑组织，，，，， ，且其表达量与WHO肿瘤的分级相关。。。 。。免疫荧光效果显示NONO的审定位与其剪接因子的作用相一致。。。 。。综合剖析批注NONO在GBM中高表达预示着预后较差（图1）。。。 。。
图1 剪接因子NONO在胶质瘤中表达上调并与肿瘤分级相关
02 剪接因子NONO影响GBM的生长
为了确定NONO在GBM爆发中的潜在作用，，，，， ，研究职员通过siRNA和shRNA敲除细胞中的NONO。。。 。。体外实验证实NONO的丧失会导致GBM细胞系（U251）和GBM患者泉源的原代细胞（P3）增殖镌汰，，，，， ，迁徙与侵袭能力降低，，，，， ，并且细胞爆发凋亡。。。 。。在小鼠体内原位异种移植U251-和P3-shNONO/NC细胞，，，，， ，经由视察发明，，，，， ，移植shNONO的细胞生长显著降低，，，，， ，细胞增殖镌汰，，，，， ，且荷瘤小鼠的总生涯期得以延伸。。。 。。综上所述，，，，， ，NONO的缺失抑制脑胶质瘤增殖，，，，， ，增进细胞凋亡，，，，， ，进一步抑制了GBM侵袭和自我更新（图2）。。。 。。
图2 敲除NONO可抑制GBM细胞系的增殖和侵袭，，，，， ，增进细胞凋亡
进一步使用慢病毒构建稳固过表达NONO的LN229和P3细胞。。。 。。CCK8、EdU、克隆形成、迁徙和侵袭等体外实验批注，，，，， ，NONO过表达增进LN229和P3细胞的生长和侵袭。。。 。。别的，，，，， ，在体内过表达NONO增进LN229-和P3异种移植瘤的生长，，，，， ，并显著缩短小鼠的生涯期（图3）。。。 。。
图3 NONO过表达增进GBM的增殖和侵袭
03 剪接因子NONO通过与PSPC1相互作用介导GPX1剪接
为了探索NONO加入GBM爆发的机制，，，，， ，研究者对U251和P3-siNONO/NC细胞举行了高通量RNA-seq剖析。。。 。。效果显示，，，，， ，NONO会影响细胞中内含子-外显子毗连的整体剪接效率，，，，， ，并在TCGA数据库GBM表达数据中进一步锁定并剖析到GPX1和CCN1的表达水平以及剪接效率下降的情形。。。 。。效果批注，，，，， ，NONO介导了GPX1和CCN1的内含子剪接，，，，， ，影响二者在卵白水平的表达。。。 。。NONO的缺失导致GPX1和CCN1基因在mRNA水平显著降低，，，，， ，但pre-mRNA水平坚持稳固或略有升高。。。 。。后续效果验证了NONO直接连系pre-mRNA中的内含子来介导GPX1和CCN1的剪接而非成熟的mRNA，，，，， ，并且在细胞核中视察到GPX1的pre-mRNA与NONO的共定位征象。。。 。。因此，，，，， ，研究者将进一步探索GPX1在NONO下游的功效（图4）。。。 。。
图4 GPX1和CCN1的表达受NONO介导的pre-mRNA剪接调控
GPX1是人体最主要的抗氧化酶之一，，，，， ，可催化过氧化氢与谷胱甘肽反应，，，，， ，维持氧化还原稳态。。。 。。研究职员基于RNA-seq数据举行了GO富集剖析，，，，， ，NONO的敲除与诱导活性氧的反应有关。。。 。。细胞水平NONO被敲除后，，，，， ，GPX活性被显著抑制、ROS水平增添，，，，， ，氧化还原稳态失衡、线粒体活性降低。。。 。。拯救实验证实，，，，， ，通过GPX1的过表达可以部分修复GBM细胞系中由于NONO敲除所带来的不良影响（图5）。。。 。。
图5 NONO的丧失通过GPX1途径引起氧化还原失衡
随后NONO各结构域在介导GPX1表达历程中的作用引起了研究者的兴趣，，，，， ，首先对NONO卵白3个结构域（RRM1、RRM2、DBHS）划分举行突变，，，，， ，构建NONO-wt与3个NONO-mut的U251细胞。。。 。。效果显示只有RRM1-mut对GPX1 mRNA的表达无显着影响，，，，， ，而RRM2-和DBHS-mut的细胞活力显著降低，，，，， ，且RRM2结构域是NONO与pre-mRNA连系所必需的。。。 。。为了进一步研究DBHS-mut细胞活力降低的缘故原由，，，，， ，通过CoIP剖析，，，，， ，最后证实了PSPC1与NONO的DBHS结构域相互作用，，，，， ，并且PSPC1在NONO介导的GPX1剪接历程中是必需的（图6）。。。 。。
图6 PSPC1协助NONO的RRM2结构域与GPX1 pre-mRNA连系并举行剪接
04 Auranofin，，，，， ，是一种治疗GBM的潜在分子药物
FDA批准的治疗类风湿枢纽炎的药物Auranofin曾报道具有抗癌活性，，，，， ，也被发明可以抑制GBM中的GPX1。。。 。。于是，，，，， ，研究者举行了体外SPR剖析，，，，， ，发明Auranofin和NONO可以直接连系并且具有较大的亲和力。。。 。。细胞耐药试验证实Auranofin通过下调NONO和GPX1的转录与表达特异性影响GBM肿瘤细胞活力，，，，， ，且Auranofin对GPX1的抑制是由NONO所介导，，，，， ，增进细胞凋亡，，，，， ，导致线粒体功效下降，，，，， ，并且能够抑制GBM细胞的侵袭。。。 。 ；；；；；谔逋馐笛榈男Ч，，，，， ，在裸鼠体内建设P3原位异种移植瘤，，，，， ，Auranofin显著抑制肿瘤生长，，，，， ，延伸肿瘤承载动物的生涯期。。。 。。异种移植组织病理效果显示NONO和GPX1表达降低，，，，， ，细胞增殖降低（图7）。。。 。。
图7 Auranofin通过NONO-GPX1途径抑制GBM
结论
该研究通过对正常细胞系、癌症细胞系以及原代细胞中的NONO等基因举行滋扰/过表达（慢病毒）。。。 。。通过体内体外实验证实晰剪接因子NONO的过表达（慢病毒）增进了GBM的希望，，，，， ，而抑制NONO（慢病毒、shRNA）会导致GPX1中内含子的保存，，，，， ，进而导致ROS增添，，，，， ，细胞凋亡和侵袭抑制。。。 。。别的，，，，， ，Auranofin可能通过靶向NONO介导的GPX1剪接体现出抗癌活性，，，，， ，Auranofin可能成为GBM患者的一种新的治疗药物，，，，， ，成为一种新的治疗战略。。。 。。
山东大学齐鲁医院李新钢教授、王剑教授和陈清静研究员为本文的配合通讯作者，，，，， ，课题组博士研究生王旭为论文第一作者，，，，， ，山东大学齐鲁医院为第一作者单位和通讯作者单位。。。 。。
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