【文库筛选】CRISPR筛选冲高分？？？临床转化来助力
01 前言
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2022年3月，，，， ，，Takashi Ishio等人在Blood揭晓“Genome-wide CRISPR screen identifies CDK6 as a therapeutic target in adult T-cell leukemia/lymphoma”，，，， ，，该研究通过全基因组CRISPR敲除筛选发明多个成人T细胞白血病淋巴瘤（Adult T-cell leukemia/lymphoma, ATLL）特异依赖的要害基因，，，， ，，并针对CDK6深入探讨，，，， ，，证实TP53失活的ATLL细胞由于CDK2激活而对CDK6抑制剂越发耐受，，，， ，，联合mTOR抑制剂可以协同抑制差别TP53状态的ATLL细胞 。。。。。。该发明为临床ATLL治疗提供了新的靶点和用药战略 。。。。。。
02 配景先容
03 研究思绪
1、通过全基因组CRISPR/Cas9失活筛选寻找ATLL细胞的依赖基因，，，， ，，扫除其他细胞普遍依赖的要害基因，，，， ，，确定9个ATLL细胞特异性依赖的候选要害基因 。。。。。。（要害基因筛 。。。。。。
2、对部分候选基因逐一验证，，，， ，，划分对各候选基因举行敲除，，，， ，，检测对ATLL细胞增殖的影响，，，， ，，然后针对差别候选基因的功效举行响应的实验探讨，，，， ，，证实候选基因有临床转化价值 。。。。。。（候选基因验证）
3、以CDK6为切入点，，，， ，，使用临床使用的CDK6抑制剂帕博西尼举行药物处置惩罚，，，， ，，证实卵白水平抑制CDK6能够也能阻滞细胞周期、增添细胞凋亡从而抑制ATLL细胞生长 。。。。。。（抑制剂处置惩罚）
4、已知TP53影响CDK6抑制剂治疗效果，，，， ，，并且能够抑制CDK2 。。。。。。通过差别TP53状态的ATLL细胞系，，，， ，，以及构建的TP53敲除细胞系，，，， ，，证实TP53失活的ATLL细胞系对帕博西尼越发耐受 。。。。。。通过进一步敲除CDK2，，，， ，，证实TP53增强帕博西尼对ATLL抑制效果依赖于其对CDK2的抑制 。。。。。。（耐药机制探讨）
5、CRISPR筛选连系通路剖析发明ATLL依赖于mTORC1信号通路，，，， ，，经由细胞增殖以及下游分子磷酸化水平检测的验证后，，，， ，，划分对ATLL细胞系、患者疏散的原代细胞以及小鼠异种移植模子举行CDK6和mTOR抑制剂药物处置惩罚，，，， ，，在体外和体内水平证实联适用药对任何TP53状态的ATLL治疗效果越发显著 。。。。。。（联适用药战略）
04 研究内容
作者对KK1、ST1和Su9T01这3个ATLL细胞系举行全基因组CRISPR失活筛 。。。。。。，， ，，在找的1278个要害基因中，，，， ，，扫除大大都细胞都依赖的焦点要害基因，，，， ，，以及两个套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）细胞系的要害基因，，，， ，，最终确定了9个ATLL细胞特异的候选要害基因 。。。。。。它们划分加入差别的调理通路，，，， ，，包括AP-1家族转录因子（BATF3和JUNB），，，， ，，细胞周期G1-S转换调理因子（CDK6和CCND2），，，， ，，JAK/STAT通路成员（STAT3和IL10RB），，，， ，，RNA连系卵白（SYNCRIP和ZFP36L2），，，， ，，和一个异戊烯转移酶亚基（PTAR1） 。。。。。。
在起源验证部分候选基因后，，，， ，，作者以细胞周期相关候选基由于切入点深入探讨 。。。。。。CCND1、CCND2和CCND3是G1/S期的细胞周期卵白，，，， ，，它们与CDK4或CDK6相互作用形成活性激酶，，，， ，，通过磷酸化并抑制Rb卵白增进G1-S期转换 。。。。。。免疫印迹显示ATLL细胞敲除CDK6后，，，， ，，Rb磷酸化水平降低 。。。。。。CDK6敲除特异性抑制ATLL细胞，，，， ，，并且可以被CDK6异位表达回补，，，， ，，CDK4异位表达回补效果较弱 。。。。。。与预期一致，，，， ，，CDK6敲除使得ATLL细胞爆发G1期阻滞，，，， ，，别的也能诱导细胞凋亡 。。。。。。敲除CCND2与敲除CDK6爆发的表型基本一致 。。。。。。
思量到CDK6对ATLL的抑制作用，，，， ，，作者进一步挖掘CDK6作为ATLL治疗靶点的潜力 。。。。。。研究批注CDK4/6抑制剂帕博西尼能够抑制多种差别细胞系，，，， ，，并且在ATLL细胞系中使得Rb磷酸化水平降低、爆发G1期阻滞以及细胞凋亡 。。。。。。既往研究发明在许多差别肿瘤类型中TP53突变与CDK4/6抑制剂耐受相关，，，， ，，将ATLL细胞系凭证TP53的状态分组，，，， ，，发明TP53变异（突变或缺失）的ATLL细胞对帕博西尼越发耐受 。。。。。。APR-246是一种能够使突变的TP53恢复转录激活性子的小分子，，，， ，，TP53突变的ATLL细胞经APR-246处置惩罚后对帕博西尼越发敏感，，，， ，，但TP53缺失的细胞没有明细的影响 。。。。。。对ST1细胞举行TP53敲除后，，，， ，，在帕博西尼处置惩罚下其生长速率高于TP53野生型的ST1细胞 。。。。。。TP53敲除介导的帕博西尼耐受也体现在细胞增殖、周期和凋亡等表型 。。。。。。TP53能通过诱导p21表达阻止G1/S期转换，，，， ，，p21连系并抑制CDK2/Cyclin E 。。。。。。在ST1细胞中，，，， ，，CDK6的失活或抑制会增添p21和CDK2抑制因子p27的表达，，，， ，，但TP53基因失活的ATLL细胞系中不会泛起这一情形，，，， ，，批注帕博西尼对ATLL细胞发心理想的抑制效果可能需要抑制CDK2 。。。。。。确实，，，， ，，对TP53突变的KK1和TP53缺失的Su9T01细胞或敲除TP53的ST1细胞在进一步敲除CDK2后，，，， ，，帕博西尼处置惩罚下的生长速率下降 。。。。。。至此，，，， ，，作者展现了TP53能通过抑制CDK2增强ATLL对帕博西尼的敏感性 。。。。。。
通过对CRISPR筛选效果举行通路剖析，，，， ，，发明ATLL细胞依赖mTORC1信号通路 。。。。。。MTOR敲除能够抑制多种ATLL细胞生长，，，， ，，免疫印迹显示ST1细胞中mTOR下游通路分子处于磷酸化状态 。。。。。。鉴于既往研究显示CDK和mTOR抑制剂联适用药对差别类型肿瘤的有益效果，，，， ，，作者使用mTOR抑制剂与帕博西尼处置惩罚差别ATLL细胞系，，，， ，，效果显示mTOR抑制剂与帕博西尼可以协同抑制差别TP53状态的ATLL细胞，，，， ，，两抑制剂联相助用对Rb磷酸化水平的抑制效果也高于划分单独用药 。。。。。。
作者进一步对ATLL患者原代细胞举行探讨，，，， ，，与细胞系实验效果一致，，，， ，，帕博西尼能够浓度依赖地抑制ATLL原代细胞增殖，，，， ，，在联合mTOR抑制剂后抑制水平增添，，，， ，，而对其他正常的T细胞没有显着影响 。。。。。。为在体内水平探讨联适用药的清静性和有用性，，，， ，，作者将ATLL细胞接种至小鼠体内建设异种移植模子并给药，，，， ，，效果显示mTOR抑制剂与帕博西尼划分单独用药时即可抑制移植瘤生长，，，， ，，联适用药后的抑制效果则越发显著，，，， ，，同时药物处置惩罚对小鼠体重没有显著影响，，，， ，，证实这一战略的清静性和有用性 。。。。。。
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