暨南大学吴开国教授/潘攀研究团队，，，在Nature子刊《Nature Communication》揭晓题为“SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ），，，该研究展示了SARS-CoV-2 N卵白通过增进NLRP3炎症小体激活诱导高炎症反应；；N卵白增进促炎因子的成熟，，，并诱发细胞和小鼠的促炎反应；；N卵白直接与NLRP3卵白相互作用，，，增进NLRP3与ASC连系，，，增进NLRP3炎症小体组装；；N卵白加重脓毒症和急性炎症小鼠模子中肺损伤，，，加速殒命，，，增进小鼠IL-1β和IL-6激活。。。。
SARS-CoV-2 N卵白诱导细胞和小鼠促炎反应
首先，，，SARS-CoV-2熏染巨噬细胞和树突细胞(DCs)后多种促炎因子趋化因子及配体均有差别水平增添；；研究职员对SARS-CoV-2卵白对IL-1β释放的影响举行研究，，，WB效果显示N卵白在HEK293T细胞表达最高(Fig.1c)，，，ELISA效果显示N卵白表达的HEK293T-NLRP3炎症小体系统IL-1β最高(Fig.1d)，，，SARS-CoV-2 N卵白增强Nigericin诱导的IL-1β渗透(Fig.1e)。。。。因此SARS-CoV-2 N卵白在IL-1β成熟及渗透中施展主要作用。。。。N卵白介导THP-1包括IL-1β在内的炎症因子表达，，， MCC950(NLRP3特异性抑制剂)可以抑制上述炎症因子的表达(Fig.1g)。。。。使用AAVlung-N在小鼠肺中表达N卵白，，，AAVlung-N可以显著增添IL-1β，，，IL-6，，，TNF，，，CXLC10，，，CCL2，，，IL-11，，，IL-7和CXCL8的mRNA表达，，，另外Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制剂，，，阻断IL-1β成熟)和MCC950对AAVlung-N诱导的上述因子表达均有差别水平的恢复作用(Fig.1h&1i)。。。。因此，，，研究职员推测N卵白增进NLRP3炎性小体激活，，，从而诱导成熟IL-1β渗透，，，进而在诱导炎症因子和细胞因子中施展要害作用。。。。效果批注，，，SARS-CoV-2 N卵白在诱导促炎因子中施展要害作用，，，N卵白可能加入调理NLRP3炎症小体的激活。。。。
Fig. 1 SARS-CoV-2 N卵白诱导炎症反应
SARS-CoV-2 N卵白诱导IL-1β成熟和IL-6爆发
思量到激动剂对促炎因子表达的主导作用，，，接下来研究职员对SARS-CoV-2 N卵白在IL-1β成熟中的作用举行研究。。。。研究发明N卵白可以增进IL-1β的渗透、IL-1β cleavage和Caspase-1成熟且泛起剂量依赖，，，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可诱导IL-1β的渗透和cleavage，，，N卵白可以进一步增进IL-1β的渗透和cleavage(Fig.2a&2b)。。。。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以增进THP-1细胞IL-18和IL-6，，，N卵白仅能增进IL-6的渗透，，，不可增进IL-18的渗透，，，MCC950抑制IL-1β和IL-6渗透；；LPS+ATP或LPS+Nigericin同样可以增进BMDM细胞的IL-1β和IL-6的渗透，，，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin对IL-6和IL-1β渗透并无显著增进作用(Fig.2c-2j)。。。。综上所述，，，N卵白诱导IL-1β的成熟和IL-6的爆发，，，并展现NLRP3是N诱导IL-1β渗透和IL-6爆发所必需的，，，因此N卵白可能在NLRP3炎症小体的激活中施展主要作用。。。。
Fig.2 N卵白诱导IL-1β成熟和IL-6天生
接下来研究者对SARS-CoV-2 N卵白在NLRP3炎症小体调控中的作用举行研究。。。。CO-IP效果显示，，，N卵白仅与NLRP3卵白相互作用，，，且His-N卵白可以直接与NLRP3卵白连系(Fig.3a-3e)，，，N卵白和NLRP3共定位于细胞质中，，，N卵白与ASC无交互作用(Fig.3f-3i)。。。。以是，，，N卵白特异性与NLRP3卵白相互作用，，，调理NLRP3炎症小体渗透。。。。
Fig.3 SARS-CoV-2 N卵白与NLRP3卵白相互作用
通过评估N卵白的截短突变体N1-N8，，，判断加入NLRP3相互作用的SARS-CoV-2 N卵白序列。。。。效果批注，，，NLRP3卵白与N1、N5、N6和N7相互作用，，，并且IL-1β渗透、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20 maturation 亦受N卵白N1、N5、N6和N7影响(Fig.4a-4e)，，，因此，，，N卵白260aa-340aa截短体加入了与NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎症小体。。。。
Fig.4 N卵白截短体加入NLRP3炎症小体激活
接下来研究职员对N卵白在调理NLRP3炎症小体因素中的作用举行研究。。。。效果显示，，，N卵白对NLRP3、Caspase-1和ASC的卵白水平没有影响，，，然而NLRP3保存时N和ASC可以相互免疫沉淀(Fig.5a-5e)。。。。因此，，，该效果提醒N卵白、NLRP3和ASC三个卵白可能形成一个重大的N-NLRP3-ASC复合物。。。。N卵白增强NLRP3与ASC的相互作用在HEK293T和A549细胞并呈剂量依赖(Fig.5f-5g)。。。。同样，，，在PMA-differentiated THP-1-N细胞中，，，Nigericin增进 N卵白在NLRP3保存的情形下与内源性ASC相互作用(Fig.5h)。。。。因此，，，SARS-CoV-2 N 增进NLRP3与ASC的相互作用。。。。
Fig.5 N卵白增进NLRP3与ASC的相互作用
SARS-CoV-2 N卵白增进NLRP3炎性小体组成
对NLRP3在细胞质中举行定位，，，NLRP3呈弥散状漫衍于细胞质，，，而SARS-CoV-2 N卵白保存时，，，NLRP3呈群集的黑点状(Fig.6a)，，，SARS-CoV-2 3a卵白与NLRP3共定位，，，但未能形成黑点状群集。。。。SARS-CoV-2 N2和N8 截短体，，，同时漫衍在细胞核和细胞质中且不可与NLRP3和共定位，，，NLRP3在HEK293T细胞的细胞质中未形成黑点状群集(Fig.6b&6c)。。。。THP-1细胞中NLRP3漫衍与HEK293T细胞和A549细胞险些一致，，，且N卵白保存时，，，内源性NLRP3卵白在细胞质中群集形成黑点(Fig.6d&6e)。。。。因此，，，SARS-CoV-2 N卵白可能增进NLRP3炎症小体复合体的形成。。。。
THP-1细胞和BMDM细胞中，，，Nigericin刺激内源性ASC卵白oligomerization，，，并且N卵白可以增进这一反应(Fig.6f&6g)。。。。别的，，，HEK293T-NLRP3细胞划分转染编码SARS-CoV-2-N卵白及其截短突变体，，，ASC oligomerization被N1、N5、N6和N7卵白激活，，，而不受N2、N3、N4、N8卵白影响(Fig.6h)。。。。以是，，，N卵白序列260aa-340aa与NLRP3相互作用，，，增进ASC oligomerization。。。。
Fig.6 N卵白增进NLRP3群集和ASC oligomerization
别的，，，研究职员还探讨了N卵白对NLRP3炎症小体复合物组装的影响。。。。将HEK293T细胞或A549细胞共转染差别质粒，，，GFP同时漫衍于细胞核和细胞质中，，，NLRP3弥散状漫衍于细胞质(Fig.7a&7b(a-e));N卵白和NLRP3表达时，，，NLRP3与N卵白共定位，，，呈黑点状(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表达时，，，GFP与ASC同时漫衍于细胞核和细胞质中，，，并形成小的环状结构(Fig.7a&7b(k-o))；；N卵白和ASC表达时，，，N卵白和ASC无法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；；GFP、ASC和NLRP3同时表达时，，，NLRP3和ASC共定位于细胞质并形成环状结构(Fig.7a&7b(u-y))；；值得注重的是，，，当N卵白、ASC和NLRP3同时表达时，，，3种卵白共定位形成球状结构(Fig.7a&7b(z-d))；；当3a、ASC和NLRP3同时保存时，，，3种卵白共定位未能形成球状结构(Fig.7a&7b(ae-ai))。。。。综上所述，，，SARS-CoV-2 N卵白增进NLRP3炎性小体复合物组装，，，而非SARS-CoV-2 3a卵白。。。。
Fig.7 N卵白增进NLRP3炎性小体组装
接下来，，，研究职员对SARS-CoV-2 N卵白在激活NLRP3炎症小体的生物学作用举行评价。。。。通过在C57BL/6小鼠表达N卵白，，，探讨N卵白在肺损伤中的作用。。。。注射AAVlung-N的小鼠，，，血清中IL-1β和IL-6的水平显着高于比照组，，，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制该反应(Fig.8a&8b)，，，但AAVlung表达N卵白并未影响血清中IL-18的表达(Fig.8c)。。。。AAVlung熏染的小鼠肺部免疫荧光效果显示，，，AAVlung-N小鼠肺部IL-1β和IL-6表达显着高于其他分组，，，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可降低IL-1β和IL-6表达(Fig.8d&8e)。。。。HE染色显示，，，携带AAVlung-N的小鼠肺部有显着的的炎症病变及组织损伤，，，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制肺组织的病变(Fig.8f)。。。。这些效果批注NLRP3炎性小体是N卵白诱导的小鼠肺损伤爆发所必需的。。。。
Fig.8 N卵白激活NLRP3炎症小体诱导小鼠肺损伤
ELISA效果显示，，，AAVlung-N诱导NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表达，，，在NLRP3-/-无显着影响，，，说明NLRP3在N卵白介导的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b)，，，对IL-18激活没有影响（Fig.9c）。。。。并且携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺组织免疫组化效果IL-1β和IL-6的表达显着高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。。。。HE病理染色同样显示携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有显着的炎症病变及组织损伤(Fig.9f)。。。。因此，，，N卵白通过激活NLRP3炎症小体诱导小鼠全身炎症，，，引发肺损伤。。。。
Fig.9 NLRP3在N卵白诱导的肺损伤中施展主要作用
综上所述，，，研究职员展现了COVID-19的病理机制，，，其中SARS-CoV-2 N卵白通过增进NLRP3炎症小体的激活从而增进炎症和肺部损伤。。。。
Fig.10 N卵白通过激活NLRP3炎症小体诱导肺损伤模子
在该研究中，，，研究职员通太过析GEO数据库(GSE155106)发明SARS-CoV-2熏染巨噬细胞和DCs会增进大宗细胞因子和趋化因子的表达。。。。通过筛选，，，研究职员发明SARS-CoV-2 N卵白通过激活NLRP3炎性小体，，，增进炎症因子的表达导致小鼠肺损伤，，，加重脓毒症模子小鼠的殒命。。。。N卵白直接与NLRP3作用，，，增进NLRP3炎性小体聚合，，，从而激活NLRP3炎性小体。。。。综上所述，，，该研究效果证实SARS-CoV-2 N卵白通过NLRP3炎症小体诱导肺损伤的新机制。。。。
● UG环球生物有幸为该研究提供AAVlung包装效劳。。。。
