【WHO慢病毒整合拷贝数标准品】之标定要领解读篇
?喜报！UG环球生物 作为海内领先的基因治疗病毒载体CDMO企业，，，，加入天下卫生组织（WHO）牵头的、全球首个基于基因治疗用慢病毒的标准品标定项目，，，，并顺遂完成使命，，，，为全球基因和细胞治疗的生长孝顺自己的焦点实力！
近年来，，，，随着Kymriah, Yescarta 以及 Strimvelis等细胞治疗产品陆续推上市场，，，，慢病毒作为细胞装载CAR历程的要害中心载体，，，，其整合拷贝数测定标准简直立更是亟待解决的要害问题。。。
现在，，，，慢病毒整合拷贝数测定要领主要是定量PCR，，，，该要领由于受标准品的选择、引物序列的选择以及反应条件等影响，，，，导致差别实验室之间检测要领及检测迅速度保存重大差别，，，，这使其在临床试验、检测以及差别实验室之间的数据难以举行较量。。。
WHO-CS633项目是由WHO及英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，，，，NIBSC）提倡，，，，通过在全球规模内差别实验室对慢病毒熏染后的HEK293T细胞基因组DNA举行拷贝数标定，，，，进而确定慢病毒整合拷贝数国际标准品。。。该项目主要接纳TaqMan qPCR，，，，SYBRGreen qPCR及ddPCR（digital PCR）三种要领对5份冻干基因组DNA举行拷贝数的检测。。。
5种基因组DNA样品编号划分为A/E（A和E是相同的样品）、B、C和D，，，，包括0、低、中或高差别拷贝数，，，，按下表（Table 1）说明举行制备后，，，，使用qPCR对A/E、B、C、C1、C2、C3、C4和D 8个样品及ddPCR对 A/E、B、C和D 4个样品举行测试。。。其中qPCR要领接纳统一个已知拷贝数的DNA标准品“NIBSC DNA standard”举行梯度稀释制备慢病毒基因与内参基因（housekeeping，，，，HK）标准曲线，，，，从而盘算慢病毒基因拷贝数与内参基因拷贝数。。。
每种要领由差别的操作员划分于3天举行3次自力的实验，，，，网络各实验室样品的原始数据和定量效果（例如qPCR Ct值或ddPCR液滴计数）举行剖析。。。
此次标定主要基于TaqMan qPCR、SYBRGreen qPCR和ddPCR 3种要领，，，，共筛选网络了全球13个国家/地区的31个实验室的检测效果。。。
其中，，，，29个实验室接纳TaqMan qPCR、13个实验室接纳SYBRGreen qPCR、11个实验室接纳ddPCR要领来评估慢病毒整合拷贝数（所有研究均使用加入标定实验室的试剂和装备举行），，，，最终获得 60 组慢病毒基因组拷贝数检测效果（包括 31 组TaqMan qPCR、15 组SYBRGreen qPCR和14组dd PCR数据），，，，共计66名实验职员加入到此次标定事情。。。
对来自差别实验室的38组qPCR和14组ddPCR的有用数据举行剖析，，，，效果批注各实验室间qPCR 测定 （n=38）的 GCV 值在14.9%-20.2%之间，，，，样品B、C、D的LV copies/cell平均值划分为1.42（1.37 - 1.48）、8.76 （8.26 - 9.29）和10.67（10.05 -11.33），，，，TaqMan qPCR与SYBRGreen qPCR效果相对一致，，，，而两种ddPCR（simplex ddPCR和multiplex ddPCR）之间保存差别（Table 2 和Figure 1）。。。
用梯度稀释的样品C作为标曲，，，，对未知样品B和D举行盘算。。。相较质粒标准品，，，，样品B和D qPCR效果的GCV值降低（样品B的GCV值从15.7%降至11.5%，，，，样品D从19.5%降至16.2%）；；；；；；而关于ddPCR效果，，，，样品D的GCV值从25.9%降至4.8%，，，，但样品B的GCV值从12.1%增添到25.2%。。。
从qPCR和ddPCR（Multiplex）综合剖析，，，，样品B和样品D的GCV值均保存降低（Table 3和Figure 1）。。。
别的，，，，本项目对样品B、C和D举行测序及含量测定（Nanodrop和QuBit），，，，这对剖析慢病毒的整合位点和基因组DNA定量提供了支持。。。
整合剖析来自全球31个差别实验室的数据，，，，整体研究数据质量较高（qPCR：38次有用数据/ 46次检测实验，，，，ddPCR：所有数据均有用），，，，qPCR检测的单细胞慢病毒拷贝数有用数据在各实验室间的GCV波动规模较小，，，，而ddPCR数据之间以及与qPCR数据比照保存差别。。。
使用梯度稀释的样品C作为标曲，，，，对未知样品B和D举行盘算。。。相较于质粒标准品，，，，样品B和D在实验室间变异性减小，，，，故使用样本C（基因组DNA）作为慢病毒整合拷贝数国际标准品，，，，镌汰了差别实验室使用质粒DNA标准品保存的潜在差别，，，，可实现慢病毒整合拷贝数检测在临床试验、检测以及实验室之间的标准化。。。
同时，，，，该项目对用于慢病毒整合拷贝数国际标准品基因组DNA的制剂处方举行了筛选，，，，并考察了8个月以上的稳固性。。。研究批注，，，，基因组DNA在经由恒久（-20℃条件下）、高温（56℃）、冻融操作后，，，，其慢病毒整合拷贝数没有显著转变，，，，批注该基因组DNA制剂可以在-20°C条件下恒久贮存并坚持稳固。。。
UG环球生物 有幸作为海内基因治疗病毒载体CDMO企业加入到该项慢病毒标准品标定事情中，，，，为推动慢病毒在临床试验、检测以及差别实验室之间的数据转达与共享孝顺实力。。。
不但从中获取履历、展现中国实力，，，，UG环球生物 也同时为宽大基因治疗研发企业带来全球化视角和国际病毒生产标准，，，，真正推动基因疗法上市应用。。。
扫一扫，，，，反响目今页面
7*12在线客服，，，，效劳咨询
倾耳聆听，，，，一个事情日内实时处置惩罚
15800353038
UG环球生物
