【Science】新手艺：dual-eGRASP带你找回大脑最深处的影象
在每小我私家的大脑深处，，，，，都有一段不可消逝的影象，，，，，或欢喜快乐，，，，，或伤心忧闷。。。。 。影象是人脑对履历过事物的识记、坚持、再现或再认，，，，，它是举行头脑、想象等高级心理运动的基础。。。。 。那么，，，，，影象存储于那里？？
在大脑中，，，，，有一类神经细胞在我们形成影象时被激活，，，，，它们被称为影象的印迹细胞（Engram cells）。。。。 。大宗研究已证实，，，，，印迹细胞保存于海马、内嗅皮层等多个脑区中，，，，，当我们贮存、提取影象时，，，，，这些细胞会被激活。。。。 。
关于影象印迹的形成，，，，，Hebb有这样一种假说，，，，，“Neurons that Fire Together, Wire Together…”，，，，，即两个神经元一起放电的时间，，，，，他们之间的突触毗连会逐步建设或增强。。。。 。然而，，，，，已往的手艺手段无法资助我们找寻影象相关的突触位置，，，，，因此我们难以研究陪同影象的形成，，，，，爆发转变的突触是否是影象相关的突触。。。。 。
为实现上述构想，，，，，我们需要标记特定两个细胞之间的突触。。。。 。已往的研究曾使用绿色荧光卵白突触重构（Green Fluorescent Protein Reconstitution Across Synaptic Partners，，，，， GRASP）手艺[1]。。。。 。这项手艺将绿色荧光卵白的两个片断划分表达在突触前或突触后的膜外貌，，，，，因此绿色荧光卵白只表达在突触位置。。。。 。那么，，，，，GRASP能否用于上述影象存储的突触机制研究呢？？
GRASP手艺
2018年4月27日，，，，，《Science》杂志刊登了韩国首尔国立大学Bong-Kiun Kaang教授的最新主要事情[2]，，，，，他们开发了强化版双GRASP手艺（dual-eGRASP）。。。。 。他们通过使用携带差别荧光卵白的AAV病毒标记印迹细胞和非印迹细胞，，，，，发明影象形成后，，，，，海马CA3印迹细胞到CA1印迹细胞的突触毗连显著增强。。。。 。
本篇事情首次区分标记突触前的印迹细胞与非印迹细胞，，，，，批注难忘影象的形成并非由于招募了更多的印迹细胞，，，，，而是由印迹细胞之间的突触毗连的强化所致。。。。 。
Bong-Kiun Kaang教授
Result:
1、Dual-eGRASP手艺区分简单神经元外貌差别泉源的突触
首先，，，，，为实现dual-eGRASP标记，，，，，作者在突触前表达青色pre-eGRASP或黄色pre-eGRASP，，，，，它们自己不会发出荧光，，，，，但若是它们与表达post-eGRASP的神经元形成突触，，，，，则会表达出青色或黄色荧光（图1A），，，，，从而能够做到标记统一个神经元上泉源差别的突触。。。。 。为验证这项手艺，，，，，作者在HEK293T细胞（图1B-C）和內嗅皮层-海马DG区的通路（图1D-E）中测试，，，，，均乐成验证该项手艺的效率。。。。 。有趣的是，，，，，对CA1而言，，，，，同侧CA3与对侧CA3神经元投射到相同区域，，，，，因此青色、黄色荧光卵白表达在相同位置（图1D-E）。。。。 。
图1 Dual-eGRASP手艺区分同个神经元差别泉源的突触
2、影象形成后CA3与CA1印迹细胞之间的投射强度更高
连系Fos-TRE系统[3]，，，，，作者使用上述dual-eGRASP手艺研究影象存储的突触位置。。。。 。他们在对侧CA3注射AAV-c-Fos-rtTA3G和AAV-TRE3G-黄色pre-eGRASP，，，，，由于只有被激活的神经元可以启动c-Fos元件，，，，，因此只有CA3印迹细胞（E）可表达黄色pre-eGRASP；；；；；他们在同侧CA3中注射少量AAV-Cre和大宗AAV-DIO-青色pre-eGRASP，，，，，以随机标记CA3神经元，，，，，轴突最后表达青色不表达黄色荧光的即非印迹细胞（N）。。。。 。又用Fos-TRE系统与红色荧光卵白标记同侧CA1印迹细胞（E），，，，，用少量AAV-Cre和大宗AAV-DIO-紫色荧光卵白随机标记CA1神经元，，，，，CA1紫色非红色神经元即非印迹细胞（N）（图2A-B）。。。。 。
通过视察，，，，，他们惊喜地发明，，，，，小鼠在场景条件恐惧实验之后，，，，，其CA3到CA1的E-E突触密度显著增添，，，，，树突棘数目增添，，，，，体积更大。。。。 。而N-N、E-N、N-E之间的突触无显着转变（图2C-E）。。。。 。
图2 影象形成后CA3印迹细胞投射到CA1印迹细胞的强度更高
3、印迹细胞之间的突触毗连强度与影象强度呈正相关
已往的研究批注，，，，，在差别的影象强度之下，，，，，印迹细胞的数目维持稳固。。。。 。作者推测印迹细胞之间的突触毗连强度可以编码影象强度。。。。 。为验证此推测，，，，，他们使用图2A相同的要领，，，，，标记CA1、CA3的印迹细胞（E）与非印迹细胞（N）。。。。 。场景条件恐惧实验中，，，，，他们将小鼠分为3组，，，，，接受高强度足底电极、低强度足底电极或不接受足底电极，，，，，以代表3种影象强度（图3A-B）。。。。 。发明随着足底电极强度的提高，，，，，小鼠颤抖行为增添。。。。 。别的，，，，，高强度足底电极条件下，，，，，E-E突触强度显著高于其他条件，，，，，而N-N、E-N、N-E之间的突触强度不受足底电极影响（图3C-F）。。。。 。
图3 印迹细胞之间的突触毗连强度与影象强度呈正相关
4、影象形成后CA3与CA1印迹细胞之间的突触转达效率更高
在图2的效果中，，，，，作者从形态学方面说明晰影象形成后CA3与CA1印迹细胞之间的投射强度更高，，，，，接下来，，，，，作者使用膜片钳电心理要领进一步验证此结论。。。。 。
他们使用Fos-rtTA系统配合AAV-TRE3G-ChrimsonR病毒标记CA3印迹细胞（E），，，，，用AAV-CaMKIIα-Chronos标记CA3所有兴奋性神经元（T）。。。。 。又用Fos-rtTA配合AAV-TRE3G-mEmerald病毒标记CA1印迹细胞，，，，，并在场景条件恐惧行为实验之后，，，，，全细胞纪录小鼠CA1印迹细胞（E）或非印迹细胞（N）。。。。 。表达ChrimsonR的神经元可被黄光激活，，，，，表达Chronos的神经元可被蓝光激活（图4A-B）。。。。 。
作者发明，，，，，场景条件恐惧行为实验后，，，，，小鼠CA3印迹细胞到CA1投射的PPR（Paired-pulse ratio，，，，，表征突触前囊泡释放的情形）降低，，，，，E-E投射PPR降低地最显著，，，，，批注突触前释放能力的增强（图4C-E）。。。。 。随后，，，，，他们使用Sr2 构建单囊泡释放诱发模子，，，，，监测兴奋性突触后电流（EPSC），，，，，发明CA1印迹细胞接受的EPSC幅度最高，，，，，批注突触后表达更多的AMPA受体（图4F-G）。。。。 。综合上述两个效果，，，，，影象的形成会改变E-E之间的可塑性，，，，，即长时程增强（LTP）。。。。 。
最后，，，，，作者在T-N、E-N、T-E、E-E之间诱导LTP，，，，，发明只有E-E之间的投射强度无转变，，，，，提醒之前影象的形成已经诱发E-E之间的LTP，，，，，因此投射强度无法进一步提高（图4H-I）。。。。 。
图4 影象形成后CA3与CA1印迹细胞之间的突触转达效率更高
总结：
影象是脑的主要高级认知功效，，，，，可是关于影象存储于哪些细胞、哪些突触我们相识未几，，，，，而该问题的解决是神经科学的焦点问题之一。。。。 。本文首次使用dual-eGRASP新手艺，，，，，标记并检测印迹细胞和非印迹细胞突触的转变，，，，，提醒影象形成后印迹细胞与印迹细胞之间的突触毗连显著增强。。。。 。本文极大提高了我们在学习影象领域的认知，，，，，这项手艺将会深入挖掘脑科学，，，，，带我们找回大脑最深处的影象！
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参考文献：
1.Cabantous, S., T.C. Terwilliger, and G.S. Waldo, Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2005. 23(1): p. 102-7.
2.Choi, J.-H., et al., Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation. Science, 2018. 360(6387): p. 430-435.
3.Liu, X., et al., Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 2012. 484(7394): p. 381-5.
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