配景
帕金森� 。。。。 。。≒arkinson’s disease, PD）是除了这个病之外 ，，，，天下第二大的神经退行性疾病 。。。。 。。为了纪念发明这一疾病的英国医生詹姆斯·帕金森 ，，，，人们将他的生日——4月11日确定为“天下帕金森日” 。。。。 。。
帕金森病的主要症状体现为运动障碍 ，，，，如运动缓慢（bradykinesia）、僵直（rigidity）、静止性震颤（tremor）等 。。。。 。。除此之外帕金森患者也体现出了感受障碍和认知功效障碍等非运动症状 。。。。 。。一项2016年的研究显示 ，，，，60岁以上晚年人群中帕金森病的患病率约为1%-2%；；；；而在80岁以上人群中 ，，，，这一比例则会上升至4%左右1 。。。。 。。现在 ，，，，我国的帕金森患者已经抵达了200万人 ，，，，占全天下帕金森病人的一半左右 。。。。 。。在我国老龄化逐步加深的配景下 ，，，，帕金森病已经成为威胁晚年人群身心康健的一大“杀手” 。。。。 。。
帕金森病最为突出的病理改变是中脑黑质中多巴胺能神经元的变性和殒命 。。。。 。。另外人们发明 ，，，，剩余神经元中路易小体的形成和α-突触核卵白的群集也是帕金森病的典范特征之一 。。。。 。。帕金森病的病因至今未明 ，，，，证据显示遗传、情形污染、朽迈等因素均在帕金森病的爆发中饰演了一定的角色 。。。。 。。
为了研究帕金森病的发病缘故原由以及探索新的临床的治疗手段 ，，，，制备有用的帕金森病动物模子有着主要的意义 。。。。 。。在本文中我们将介绍3种主流的帕金森病的动物模子的原理和制备要领 。。。。 。。而在下期 ，，，，我们将介绍磨练巨细鼠帕金森模子造模效果的病理和行为学要领 。。。。 。。
1.MPTP诱导小鼠帕金森模子
1982年 ，，，，7个来自加利福尼亚州圣克拉拉县的“嬉皮士”在吸食了一种合成后被紧迫送往医院救治 。。。。 。。医生惊讶地发明 ，，，，这7位患者虽然年岁轻轻 ，，，，行动却像百岁老人一样缓慢 ，，，，并陪同有肢体震颤的征象 ，，，，和帕金森病的体现十分相似 。。。。 。。进一步的磨练批注 ，，，，这批合成中含有一种名为1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）的杂质2 。。。。 。。1984年 ，，，，斯坦福大学的神经学家威廉·兰斯顿确认MPTP正是导致这些年轻人泛起帕金森样症状的罪魁罪魁3 。。。。 。。
从原理来看 ，，，，MPTP自己对细胞并无迫害作用 。。。。 。。可是当MPTP进入体内后 ，，，，由于自身优异的脂溶性 ，，，，MPTP可以容易穿过血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）进入中枢神经系统4 。。。。 。。而在脑中 ，，，，MPTP会被神经胶质细胞中的单胺氧化酶B（MAO-B）代谢为一种名为MPDP +的中心体 。。。。 。。而该中心体再经由进一步的氧化 ，，，，最终形成有毒的代谢物甲基-苯基四氢吡啶鎓盐（MPP +）5 。。。。 。。
MPP+的结构靠近多巴胺 ，，，，因此会过失地被中脑多巴胺神经元膜上的多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）选择性重吸收进入细胞内6 。。。。 。。而一旦进入细胞 ，，，，MPP+则会“凶相毕露” ，，，，它会抑制线粒体呼吸链复合体I的活性7 ，，，，从而阻断电子转移链 ，，，，镌汰ATP的天生并增进活性氧(reactive oxygen species, ROS)的爆发 ，，，，最终造成神经元的损伤8 。。。。 。。
图1 MPTP的代谢途径和MPP+在胞内的路径
正由于MPTP是第一个也是现在能够在人类身上复现帕金森症状的神经毒素（某种意义上还要谢谢这几位加州的年轻人） ，，，，MPTP诱导的帕金森模子成为了在模式动物上研究帕金森病临床疗法的“金标准” ，，，，尤其是MPTP诱导的非人灵长类（如恒河猴）帕金森模子 。。。。 。。而MPTP诱导的小鼠帕金森模子由于造模手艺相对简朴（只需要腹腔注射）、对多巴胺神经元的杀伤效果稳固也获得了普遍的认可 。。。。 。。不少关于多巴胺能神经元殒命机制方面的研究都接纳MPTP诱导的小鼠帕金森模子作为实验范式 。。。。 。。
动物：雄性C57BL/6 ，，，，约莫7-8周龄 ，，，，体重25-30 g 。。。。 。。注重MPTP诱导的小鼠帕金森模子对动物的性别、体重、年岁甚至品系泉源（是Jackson lab照旧Charles River）均很是敏感 。。。。 。。在挑选动物的时间要十分小心 。。。。 。。
饲养：订购的动物到位后 ，，，，在注射前务必顺应性饲养1周左右 。。。。 。。由于长距离运输会改变脑的状态 ，，，，因此需要5-7天时间来使动物恢复并顺应情形 。。。。 。。
注射：在注射当天配制好新鲜的MPTP溶液 ，，，，然后每只动物按14-20 mg/kg体重的剂量腹腔注射MPTP 。。。。 。。距离2小时后举行下一次注射 ，，，，当天共举行4次注射 。。。。 。。
术后照顾护士：注射之后约莫30分钟 ，，，，小鼠就会泛起类似帕金森的症状 ，，，，如强直或震颤等 。。。。 。。而在约莫3小时后未被代谢的MPTP将会随着动物的渗透物被释放到垫料中 。。。。 。。因此在注射之后小鼠需要举行严酷的隔离饲养 。。。。 。。其使用的垫料、饮水必需经由无害化处置惩罚 ，，，，然后作为医疗垃圾放弃 。。。。 。。约莫3-4周后可以对动物的病理和行为体现举行检测 。。。。 。。
2.6-OHDA诱导帕金森模子
6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）是多巴胺的羟基化衍生物 ，，，，于1959年首先被Senoh等人乐成疏散9 。。。。 。。自觉现以来的半个多世纪中 ，，，，6-OHDA一直在帕金森病的临床前研究中饰演着主要角色 。。。。 。。由Ungerstedt和Arbuthnott在1970年配合建设的单侧注射旋转模子成为了在模式动物上被最为普遍使用的帕金森模子之一10 。。。。 。。
6-OHDA对神经元的迫害作用有一个“两步走”的历程 。。。。 。。第一步是特异性地在多巴胺能神经元内的积累 。。。。 。。由于6-OHDA的结构和儿茶酚胺类似 ，，，，因此释放在细胞间质中的6-OHDA会被多巴胺神经元胞体或突起上的多巴胺转运体过失地识别并重吸收进入细胞（图2） 。。。。 。。第二步则是细胞毒性 。。。。 。。当6-OHDA进着迷经元后 ，，，，一方面将会被单胺氧化酶-A（MAO-A）催化形成过氧化氢（H2O2） 。。。。 。。过氧化氢自己具有很强的细胞毒性 ，，，，同时也会触发氧自由基的形成12 。。。。 。。而另一方面 ，，，，自动氧化（autooxidation）作用所大宗爆发的活性氧和醌类产品凌驾了细胞内抗氧化酶的遭受能力 ，，，，导致细胞结构和代谢的杂乱 ，，，，最终效果就是神经元的损伤（图2） 。。。。 。。
图2 6-OHDA介导的神经毒性作用机制
与MPTP差别的是 ，，，，6-OHDA并不可穿透血脑屏障 。。。。 。。因此为了抵达中枢神经系统毁伤的效果 ，，，，在使用6-OHDA举行帕金森造模时需要使用脑立体定位注射手艺将6-OHDA注入到黑质-纹状体（striatonigral）这一多巴胺能投射通路中 。。。。 。。详细的注射位点可以是黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）、纹状体（striatum）或者位于二者之间的前脑内侧束（MFB） 。。。。 。。
动物：6-8周龄的C57/BL小鼠 ，，，，牝牡不限 ，，，，体重20-25 g左右 。。。。 。。
饲养：与MPTP诱导的模子相同 ，，，，动物订购之后需要至少顺应性饲养1周后再举行造模手术 。。。。 。。
脑定位注射：在33G的Hamilton注射器或玻璃电极中预先吸入1 μL左右浓度为3 μg/mL的6-OHDA溶液 。。。。 。。小鼠麻醉后牢靠在脑立体定位仪上 。。。。 。。剪开头皮后用棉签轻轻擦拭颅骨外貌将前囟（bregma）和后囟（lambda）点袒露出来 。。。。 。。调理立体定位仪 ，，，，将前囟和后囟点的高度调理到一致从而使颅骨坚持水平 。。。。 。。以bregma点为原点 ，，，，找到注射位点所在的坐标 ，，，，用牙科钻将注射位点上方的颅骨钻开一个小洞 。。。。 。。在6-OHDA诱导的模子中 ，，，，注射位点可以是黑质（AP -2.90 mm; ML +1.10 mm; DV -4.50 mm） ，，，，也可以是前脑内侧束（AP -1.20 mm; ML +1.10 mm; DV -5.00 mm）或纹状体（AP +0.2 mm; ML ±2.00 mm; DV -2.60 mm） 。。。。 。。将玻璃电极或注射针缓慢插入注射位点 ，，，，以0.2 μL/min的速率将6-OHDA注射到目的脑区 。。。。 。。注射竣事后 ，，，，注射针应该继续停留在注射位点5分钟左右以使药物能够充分扩散 。。。。 。。提起注射针 ，，，，将动物的头皮缝合并消毒 。。。。 。。
术后照顾护士：脑定位注射完成后将动物放在加热板或灯光下照射坚持体温 。。。。 。。待动物苏醒后放回笼中 。。。。 。。术后3天内天天腹腔注射一次抗生素 。。。。 。。约莫3-4周后可以举行行为学检测 。。。。 。。
3.基于α-突触核卵白的模子
除了多巴胺神经元丧失之外 ，，，，帕金森病的另一种典范的神经病理标记是剩余的神经元胞质内泛起一种嗜酸性的容纳体 ，，，，即路易小体（Lewy bodies, LBs） 。。。。 。。显微镜下泛起圆形的粉红色均质结构 。。。。 。。路易小体的主要组成因素是一种叫做α-突触核卵白（α-synuclein, α-Syn）的突触前卵白 。。。。 。。大宗证据显示 ，，，，α-突触核卵白的群集和路易小体的形成与多巴胺神经元的殒命有着亲近的联系13 。。。。 。。
α-突触核卵白由SNCA基因编码 ，，，，是一种主要表达在突触前和核周的可溶性卵白 。。。。 。。α-突触核卵白简直切功效至今仍不清晰 ，，，，不过有证据显示可能与突触可塑性或神经递质释放相关 。。。。 。。正常状态下的α-突触核卵白以单体（monomers）或者α螺旋状（α-helical）折叠的四聚体形式保存 ，，，，可溶并且鲜有群集的情形；；；；但在病理状态下 ，，，，α-突触核卵白会改变构象为富含β片状（β-sheet）折叠的结构 。。。。 。。过失折叠的α-突触核卵白会群集起来形成寡聚体 ，，，，并逐渐向纤维原和不溶性纤维的形态生长 ，，，，最终沉积在路易小体中 。。。。 。。除此之外 ，，，，大宗研究证据批注 ，，，，过失折叠的α-突触核卵白可以体现出朊病毒（prion）的性子 ，，，，诱发内源α-突触核卵白的过失折叠和群集 ，，，，并通详尽胞间转达的方法在神经元之间扩散 。。。。 。。
相比于使用神经毒素杀伤多巴胺神经元的帕金森模子 ，，，，基于α-突触核卵白的帕金森病模子由于在时程上能够较好地模拟帕金森病爆发、生长的全历程 ，，，，这有利于发明和识别新的治疗靶点 。。。。 。。在诸多基于α-突触核卵白的帕金森模子中 ，，，，近年来被最普遍使用的模子可以归纳为2种：预制纤维（pre-performed fibrils, PFFs）和AAV病毒颗粒模子 。。。。 。。
使用α-突触核卵白的预制纤维举行造模首先需要制备PFFs 。。。。 。。简而言之 ，，，，预制纤维首先在体外由重组的α-突触核卵白单体天生 。。。。 。。接下来 ，，，，群集成原纤维的α-突触核卵白被提取出来并超声破碎为短纤维的形式14 。。。。 。。使用脑立体定位注射的方法将PFFs注射进脑内 ，，，，在约莫12周后将会诱发内源α-突触核卵白的群集、磷酸化和泛素化反应 。。。。 。。
另一种有用的方法是使用重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）外源过表达野生型或点突变型（如A53T）α-突触核卵白 。。。。 。。值得注重的的是 ，，，，构建AAV载体接纳的血清型和启动子 ，，，，以及病毒注射的滴度和剂量都会对α-突触核卵白过表达的效率爆发影响15 。。。。 。。现在的研究显示 ，，，，使用常用的CMV或者hSyn启动子均可以提供高水平的基因表达效率 。。。。 。。另外 ，，，，使用一些转录后调控元件 ，，，，如土拨鼠肝炎病毒转录后调理序列（WPRE）或者poly(A)尾巴同样可以显著提高转基因的效率 。。。。 。。
动物：6-8周龄的C57/BL小鼠或PD相关的转基因鼠 ，，，，牝牡不限 ，，，，体重20-25 g左右 。。。。 。。
饲养：动物订购之后需要至少顺应性饲养1周后再举行脑定位注射 。。。。 。。
脑定位注射：使用10 μL ，，，，33G的Hamilton注射器预先吸入2.5 μL左右α-突触核卵白PFFs ，，，，其中α-突触核卵白纤维的含量约为5 μg 。。。。 。。动物开颅和调平操作于6-OHDA注射一致 。。。。 。。α-突触核卵白通常被单侧注射在纹状体（AP +0.2 mm; ML ±2.00 mm; DV -2.60 mm） 。。。。 。。注射针缓慢插入注射位点 ，，，，以0.1 μL/min的速率将PFFs注射到目的脑区 。。。。 。。注射竣事后 ，，，，注射针应该继续停留在注射位点5分钟左右以使纤维充分扩散 。。。。 。。最后提起注射针 ，，，，将动物的头皮缝合并消毒 。。。。 。。
若是是病毒注射 ，，，，则构建AAV2/1-A53T(人类α-突触核卵白A53T点突变型)-EGFP-WPRE病毒载体 ，，，，用注射器或玻璃电极吸收1.5 μL ，，，，滴度为2-3×1012 v.g./mL病毒 ，，，，并以0.1 μL/min的速率单侧注射在黑质（AP -3.1 mm; ML -1.4 mm; DV -4.4 mm） 。。。。 。。
图3 纹状体注射的坐标示意图
术后照顾护士：脑定位注射完成后将动物放在加热板或灯光下照射坚持体温 。。。。 。。待动物苏醒后放回笼中 。。。。 。。术后3天内天天腹腔注射一次抗生素 。。。。 。。约莫90天后动物会逐渐体现出帕金森表型 。。。。 。。
