中枢神经系统的发育和学习诱导的神经环路重构都受到基因表达的时空调控。。。。。组卵白重构在心理和病理条件下调控这类基因的表达起着主要作用 ，，因此 ，，组卵白重构可能成为许多重大脑疾病的潜在药物靶点。。。。。
组卵白甲基转移酶被确以为许多神经发育障碍的危害基因。。。。。Ash1l是一种组卵白甲基转移酶 ，，属于三胸家族（trxG）卵白的成员之一 ，，其能拮抗多梳卵白家族对基因转录的抑制功效。。。。。现在越来越多的研究证实 ，，Ash1l基因功效缺失是自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）爆发的主要危险因素 ，，然而 ，，关于Ash1l单倍体缺乏导致与 ASD相关致病机制尚不清晰。。。。。
2022年1月26日 ，，上�？？？？？？萍即笱蒲в胧忠昭г汗芗山淌谕哦邮褂肁sh1l缺失小鼠模子、行为学范式、光遗传学等多个手艺手段发明Ash1l单倍体缺乏导致小鼠ASD样行为 ，，破损运动依赖的突触修剪历程 ，，并对该征象举行了系统性探索 ，，相关研究效果刊发在神经科学期刊Neuron上 ，，问题为ASH1L haploinsufficiency results in autistic-like phenotypes in mice and links Eph receptor gene to autism spectrum disorder
效果
前脑神经元Ash1l单倍体缺乏导致小鼠的ASD样表型
首先 ，，作者较量了Ash1l+/-小鼠[1,2]和WT小鼠的行为学表型 ，，在Ash1l+/-小鼠中检测到了单倍体缺乏 ，，同时 ，，旷场实验（the open-field test）和埋珠实验（the marble-burying test）行为学范式效果显示 ，，Ash1l+/-小鼠体现类似焦虑、重复刻板的行为（图1A,B）。。。。。别的 ，，对出生后7-9天（P7-P9）小鼠举行幼鼠超声发声测试 ，，发明Ash1l+/-小鼠在生命早期保存现相同障碍的征象（图1C）。。。。。三箱社交实验（three-chamber assay）效果显示Ash1l+/-小鼠也体现出社交障碍（图1D）。。。。。这些效果提醒了Ash1l突变小鼠体现出典范的自闭症样行为 ，，包括相同难题 ，，重复刻板行为、社交障碍等。。。。。
单细胞基因表达剖析发明 ，，在中枢神经系统中 ，， Ash1l优先在神经元中表达（图1E）。。。。。因此 ，，研究职员借助原位杂交链式反应（HCR-FISH）做进一步验证 ，，发明在皮层神经元中 ，，Ash1l阳性信号与Map2阳性信号（(Map2+ ，，神经元标记物）高度重叠（图1F）；；；；在Map2-细胞中 ，，Ash1l信号点数目显着镌汰。。。。。这提醒了神经元中Ash1l功效缺失可能导致自闭症谱系障碍 (Autism Spectrum Disorder, ASD）样行为。。。。。
基于上述效果 ，，作者构建Ash1lEmx1-cKO小鼠（特异性在前脑 ，，特殊是新皮层和海马区敲除Ash1l,图1G-I） ，，并通过行为学范式发明 ，，前脑Ash1l单倍体缺乏导致小鼠ASD样行为（图1J-L）。。。。。
图1 Ash1l单倍体缺乏导致小鼠的ASD样表型
Ash1l突变小鼠保存区分能力缺陷
接下来 ，，研究职员对Ash1l缺失小鼠的学习行为举行评估 ，，借助条件性恐惧反射范式发明 ，，Ash1l+/-小鼠和WT小鼠均学会了情境性恐惧条件反射 ，，并体现出类似的恐惧影象重提水平 ，，然而Ash1l+/-小鼠在恐惧学习的第三天体现出木僵行为（freezing, 老鼠的一种防御反应）下降；；；；别的 ，，在Ash1l+/-小鼠中未视察到两种差别情形下的木僵行为差别（WT小鼠在context A中体现出较高的木僵行为 ，，在context B（新情形）中体现出较低的木僵行为） ，，提醒了Ash1l+/-小鼠区分能力受损（图2A,B）。。。。。
在音调依赖的区分范式（图2C-E）和基于音调的Go-No-go行为范式（图2F-H）中 ，，Ash1l+/-小鼠同样体现出显着的听觉区分障碍（听觉脑干反应（ABR）测试Ash1l+/-小鼠无显着的听力损失）。。。。。
为了验证前脑神经元中Ash1l缺失是否会导致与Ash1l+/-小鼠类似的区分能力障碍征象 ，，作者借助Ash1lEmx1-cKO小鼠举行相关行为学范式 ，，发明Ash1lEmx1-cKO小鼠与恐惧影象相关的听觉区分能力显着受损（图2J,K）。。。。。这种Ash1l突变小鼠的区分能力异常切合部分ASD患者的临床体现。。。。。前脑Ash1l缺失可导致突触和神经环路功效障碍 ，，以及区分行为障碍。。。。。
图2 Ash1l+/-小鼠体现出正常的学习能力 ，，但区分能力受损
Ash1l以细胞自主效应的方法介导运动依赖的突触修剪历程
随后 ，，作者借助高尔基染色发明 ，，1月龄的Ash1l+/-小鼠皮层神经元和背侧纹状体中棘神经元（MSNs）的树突棘密度显著增添（图3A） ，，为研究这种征象是否源于突触消除历程（synapse elimination）的镌汰 ，，研究职员研究了Ash1+/-小鼠原代皮层神经元的突触密度转变。。。。。用表达ChR2光敏卵白的慢病毒载体（Lenti-CaMKIIa-ChR2）熏染作育的神经元 ，，并用LED刺激（图3B） ，，发明WT神经元在LED刺激后24h树突突触素（SYP）密度显著降低 ，，而Ash1l+/-组则未视察到这种征象（图3C,D） ，，提醒了Ash1l可能介导了运动依赖的突触修剪历程。。。。�；；；；钐宄上裥Ч允� ，，Ash1l+/-组作育的神经元中 ，，活性依赖的突触消除历程被削弱。。。。。
别的 ，，作者还研究了在小鼠新皮层中活性依赖的突触消除 ，，追踪了听觉皮层（auditory cortex, AUD）到后顶叶皮层（posterior parietal cortex, PTLp）长距离投射轴突的转变。。。。。研究职员将AAV-EF1a-DIO-EYFP注射在Rbp4-Cre小鼠AUD ，，特异性标记听觉皮层L5神经元（图3H）。。。。。小鼠接受音调依赖的恐惧条件训练 ，，成像视察轴突转变发明 ，，声调依赖的恐惧条件学习24h后 ，，Ash1l+/-::Rbp4-Cre小鼠“bouton”（突触小结）的扫除显着低于WT小鼠 ，，而“bouton”形成则坚持稳固（图3H-J）。。。。。
为探讨这种“突触修剪”历程的缺失是否由Ash1l缺失神经元的细胞自主效应导致的 ，，研究职员将AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP注射于Ash1lfl/fl小鼠右侧AUD区（图3K） ，，对小鼠举行音调依赖的恐惧条件行为学范式训练 ，，在学习之后借助体内成像手艺追踪突触的转变 ，，发明Ash1l缺失的神经元中学习依赖的突触的增添数目没有爆发改变 ，，而学习诱发的突触的镌汰数目显著低于正常小鼠（图3K-M）。。。。。这些数据提醒了Ash1l以细胞自主效应的方法介导皮层神经元的运动依赖的突触修剪历程。。。。。
图3 Ash1l以细胞自主效应的方法介导运动依赖的突触修剪历程
Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达
接下来 ，，作者研究了其分子机制 ，，通过对转录组剖析及基因本体论（GO）剖析发明 ，，Eph受体EphA7在听觉皮层和背侧纹状体中的表达均显著下调（图4A-C） ，，基于此 ，，研究职员进一步将EphA7作为加入Ash1l介导的突触修剪历程的主要基因之一举行了研究。。。。。
Eph受体及其配体 Ephrin 统称为Eph家族卵白 ，，是卵白酪氨酸激酶家族中的最大成员。。。。。Eph/ephrin卵白作为细胞外貌分子 ，，加入调理突触的形成及神经元的可塑性 ，，EphA7是编码Eph受体中14个受体卵白基因之一 ，，在皮质发育和突触功效中施展主要作用。。。。。
随后 ，，研究职员借助音调依赖的恐惧条件行为学范式 ，，在体内/体外均发明Ash1l+/-小鼠听觉皮层运动依赖的神经元中EphA7表达远低于WT小鼠的（图4D-I） ，，提醒了在Ash1l+/-小鼠中EphA7运动诱导表达受损。。。。。
图4 Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达
Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3来调控EphA7的表达
进一步 ，，作者探讨Ash1l是怎样加入调控EphA7运动诱导表达 ，，通过染色质免疫沉淀手艺（ChIP）发明 ，，Ash1l的直接靶点H3K36me2在WT和Ash1l+/-小鼠AUD EphA7基因位点周围没有显着差别 ，，然而H3K27me3信号（组卵白甲基转移酶复合体PRC2催化的抑制性标记物）在Ash1l+/-小鼠EphA7基因位点显著增添（图5A,B）。。。。。同时 ，，Ash1l+/-小鼠中H3K27ac（一个活跃的增强标记。。。。。H3K27ac与H3K27me3共享一个位置 ，，保存拮抗作用。。。。。）表达一连下降 ，，用NaB（组卵白去乙�；；；；敢种萍粒┰ごχ贸头Ｗ饔纳窬⒚� ，，刺激Ash1l+/-神经元后H3K27ac升高 ，，EphA7表达恢复（图5C,D）。。。。。同样地 ，，行为学效果显示 ，，Ash1l+/-小鼠中H3K27me3、EZH2（PRC2复合体的一个主要的催化酶）表达水平显著增添（图5E-G）。。。。。通过UNC1999（EZH1/2抑制剂）对作育的神经元举行预处置惩罚 ，，发明Ash1l+/-激活的神经元中EphA7表达受到抑制的征象获得改善（图5I）。。。。。上述效果提醒了 ，，Ash1l在活性依赖的PRC2介导的转录抑制累积中施展拮抗作用 ，，从而允许EphA7在激活的神经元中表达。。。。。
图5 Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3默然来调控EphA7的表达
EphA7高表达可改善Ash1l+/-小鼠突触修剪历程缺陷和行为异常
基于上述效果 ，，研究职员研究了提高EphA7受体活性是否能改善Ash1l突变小鼠的突触修剪历程缺陷和行为异常。。。。。Ephrin-A5是EphA7的高亲和力配体 ，，加入下游信号[3,4]。。。。。作者在作育的神经元和小鼠听觉皮层中应用Ephrin-A5多聚体的Fc融合卵白（Ephrin-A5 Fc）直接刺激EphA7活性[5,6] ，，发明改善了Ash1l突变小鼠的突触修剪历程和行为异常（图6）。。。。。
图6 Ephrin-A5激活EphA7高表达Ash1l+/-小鼠突触修剪历程缺陷和行为异常
结论
本文借助转基因模子鼠、多种行为学范式、光遗传学手艺、活体成像转录组剖析及基因本体论剖析等多种手艺手段 ，，研究发明前脑神经元Ash1l单倍体缺乏可导致小鼠爆发相同难题、重复刻板行为、社交障碍等类似自闭症样表型 ，，并机制上破损运动依赖的突触修剪历程 ，，这是以细胞自主效应方法介导的。。。。。进一步研究发明 ，，Ash1l可通过介导EZH2-H3K27me3去抑制作用提高EphA7的活性依赖表达 ，，进而影响突触消除历程 ，，并改善Ash1l+/-小鼠区分能力障碍及行为障碍。。。。。该研究有助于深入相识ASD相关发病机制 ，，为其干预治疗提供了新的思绪。。。。。
作者先容及基金信息
正在上科大管吉松教授课题组举行相助研究的2017级博士研究生闫宇泽(清华大学)和上科大生命学院的田苗苗博士为本文的配合第一作者。。。。。上科大生命学院研究生 2016级陈琪楠、2017级郭修贤、2018级李萌、2019级周罡也对本研究做出了主要孝顺。。。。。管吉松教授、青岛大学隶属医院刘世国教授和清华大学熊巍教授为本文的配合通讯作者 ，，研究获得中国科学院遗传发育所吴青峰研究组、上海理工大学谢红研究组的鼎力大举支持。。。。。研究也获得了上科大戚炜教授、范岑岭教授和上海交通大学医学院徐楠杰教授大宗的有益资助。。。。。
该研究受到科技立异2030-重大项目资助 ，，和自然科学基金项目以及上海市科委项目支持。。。。。
UG环球生物有幸提供实验中使用的AAV、慢病毒载体 ，，用现实验动助力中国脑科学的生长。。。。。
参考文献
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