真核有参转录组测序
转录组广义上指特定细胞在某一功效状态下的所有转录产品，，包括mRNA 和非编码RNA（ncRNA）。。。。是毗连基因组遗传信息与生物功效的必定纽带。。。。真核生物转录组测序基于高通量测序，，可快速获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的荟萃，，用于研究基因结构和基因功效、可变剪接和新转录本展望等。。。。
转录组研究能够从整体水平研究基因功效以及基因结构，，已经成为展现生物生长发育调控和逆境胁迫顺应机制、生物进化纪律、疾病爆发生长的主要机制以及发明致病基因调控的要害靶点等方面的优先研究手段，，现在已普遍应用于基础研究、临床诊断和药物研发、动植物育种等各个领域。。。。
UG环球组学优势
1.全流程效劳： 提供从生物样品到可视化数据的全套组学效劳；；；
2.富厚项目履历：具备处置惩罚重大样本的能力，，同时具有富厚的建库履历；；；
3.流程化剖析：完善的剖析流程，，准确快速剖析组学数据；；；别的可连系客户的需求无邪举行定制化信息剖析；；；
4.专业化团队：资深科学照料具有富厚的计划设计、售后效劳履历，，全程一对一相同；；；
5.一站式解决计划：拥有一站式多组学效劳，，助力基础研究及临床治疗。。。。
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
|
动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
|
植物叶片组织/花 |
>200mg |
|
植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
|
原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
|
中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×107个 |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 组织样本建议生涯在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织生涯液中，，然后-80℃生涯或干冰寄送；；；
② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，，-80℃生涯或干冰寄送；；；
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服。。。。
生物信息学剖析内容
应用场景
应用场景1：差别基因筛选与功效剖析
适用规模：临床医学、基础医学、生物化学、动植物及真菌研究等恣意偏向
使用真核有参转录组测序，，可通过较量实验组和比照组基因表达量筛选差别表达的基因。。。。然后对差别表达基因举行进一步锁定，，如通过GO、KEGG富集剖析及GSEA剖析，，配合Pubmed中已揭晓的文献以及课题组中已积累的部清楚星分子对差别表达基因举行功效注释，，并进一步剖析关注的功效基因。。。。进入实验验证阶段后可对筛选到的差别基因举行qPCR、Northern、Western Blot、FISH验证、基因敲除及过表达等。。。。
应用场景2：时序剖析或浓度梯度剖析
适用规模：临床样本、细胞样本、动植物样本有多个时间段的样本，，或差别药物浓度处置惩罚的样本
在转录组数据剖析历程中，，有一类特殊的实验设计。。。。通过对差别时间段的实验样本举行搜集，，或测试差别的药物、试剂等浓度梯度的样本举行收罗。。。。继而研究差别基因在差别时间段或差别浓度梯度间的表达纪律，，这一类剖析通常称之为“时序剖析”
应用场景3：转录因子/调控因子/剪切因子等上游调控基因挖掘
适用规模：临床医学、基础医学、生物化学、动植物研究等恣意研究偏向
通例转录组差别剖析极有可能获得大宗的差别基因，，这对后期实验验证的目的锁定带来挑战。。。。在没有特定感兴趣的通路及明星分子条件下，，转录因子是一个很是不错的切入偏向。。。。转录因子可以调理基因组DNA开放性、召募RNA聚合酶举行转录历程、召募辅助因子调理特定的转录阶段，，调控诸多生命历程，，诸如免疫反应、发育模式等。。。。以是，，剖析转录因子表达及其调控活性关于剖析重大生命活动具有主要意义。。。。其他调理因子包括可变剪切等调控基因也可以加入上游调控。。。。
应用场景4：大样本研究
适用规模：动植物育种、遗传群体与物种起源、人群行列与生物标记物挖掘
随着测序手艺的飞速生长，，少量样本的转录组测序研究已经无法诠释重大的生物学问题。。。。研究者们已最先使用大样本量的转录组样本，，连系统计学与机械学习等方法，，知道切合特定纪律和研究目的的焦点基因。。。。如孟德尔随机化、相关性剖析、线性回归、LASSO回归、Cox回归等，，剖析差别样本基因或基因组多样性，，挖掘更深入和周全的生物学意义。。。。
项目文章
【1】Liang H, et al. Siglec15 facilitates the progression of non-small cell lung cancer and is correlated with spinal metastasis. Ann Transl Med. 2022 Mar;10(6):281. PMID: 35434017.
【2】Pi Y, et al. The role of PIWI-interacting RNA in naringin pro-angiogenesis by targeting HUVECs. Chem Biol Interact. 2023 Feb 1;371:110344. PMID: 36623717.
LncRNA测序
长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt 的非编码RNA（ncRNA），，普遍保存于种种生物体内，，在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分解调控等众多生命活动中施展主要作用，，与动植物的生长发育，，人类的疾病爆发有着亲近关系，，也可作为疾病诊断的标记物或是主要靶点。。。。
使用高通量测序手艺举行lncRNA 测序及生物信息学剖析，，可快速准确地发明那些具有主要调控功效的lncRNA，，剖析其与特定生物学历程的关系，，深入探索lncRNA的功效及其表达调控机制。。。。包括竞争连系miRNA的ceRNA调控机制，，及对染色质结构举行一系列调控如增强子、启动子、绝缘子等。。。。
手艺优势
1. 文库优化：接纳核糖体去除和链特异性文库构建计划，，保存了完整的lncRNA和mRNA序列，，以及序列偏向性。。。。
2. 序列完整：对样本中险些所有的lncRNA和mRNA序枚举行判断和剖析。。。。
3. 物种多元：对包括人类、动植物在内的许多物种的lncRNA举行判断和剖析。。。。
4. 剖析严谨：系统网络lncRNA数据库用于判断已知lncRNA，，并设置严酷的筛选条件用于发明新lncRNA。。。。
5. 关联周全：开展lncRNA与mRNA的关联剖析，，深入剖析lncRNA调控网络。。。。
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
|
动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
|
植物叶片组织/花 |
>200mg |
|
植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
|
原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
|
中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×107个 |
|
外泌体样本 |
>1×108个 |
|
血清/血浆/脑脊液/枢纽积液/卵泡液 |
>2mL |
|
细胞作育上清液 |
>20mL |
|
尿液 |
>30mL |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 组织样本建议生涯在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织生涯液中，，然后-80℃生涯或干冰寄送；；；
② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，，-80℃生涯或干冰寄送
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服
应用场景
应用场景1：启动子/增强子调控
适用规模：非线性转录调控、新顺式作用元件发明及功效判断、组织特异性启动子筛选及确定等研究
lncRNA的自身转录会滋扰其相近编码卵白的基因的转录。。。。上游lncRNA转录时，，会穿越相近靶基因的启动子区，，滋扰了转录因子与靶基因的启动子连系，，从而抑制靶基因的转录。。。。别的，，lncRNA具有增进增强子环化和激活基因表达的功效。。。。在没有成环的情形下增强子处于非活性状态。。。。
应用场景2：与卵白修饰/DNA甲基化/m6A联合
适用规模：临床医学、基础医学、植物遗传育种等研究
lncRNA加入表观调控，，可能是招募一些染色质重构复合体来介导基因默然，，尤其是一些与组卵白修饰相关的组卵白甲基转移酶的调控。。。。别的，，lncRNA还能与一些DNA甲基化和去甲基化酶连系使得基因的启动子区爆发甲基化的转变从而影响基因表达。。。。
应用场景3：ceRNA调控机制
适用规模：情形应激、临床医学、植物遗传育种、疾病早期诊断等研究
ceRNA全称competing endogenous RNA，，是一种能够竞争连系RNA的作用元件。。。。通常lncRNA和circRNA会竞争连系miRNA，，我们一样平常把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。。。。ceRNA调控网络全称ceRNAregulation network，，指的是有ceRNA加入的整个调控网络cascade。。。。而ceRNA剖析指的是对整个ceRNA调控网络举行剖析。。。。一样平常有circRNA-miRNA-mRNA剖析或lncRNA-miRNA-mRNA剖析。。。。
效果展示
差别样本lncRNA基因组可视化效果为了更直观的展示lncRNA candidate在染色体中漫衍情形，，我们接纳circos(ww.circos.ca)软件对筛选获得的lncRNA举行基因组mapping。。。。
主要分为两部分举行展示，，一部分凭证lncRNA的差别分类举行基因组mapping，，另一部分凭证差别样本中lncRNA举行基因组mapping。。。。作图时划分将每条染色体凭证每25mb为基本单位，，差别样本中lncRNA基因组可视化作图时统计每个区段中lncRNA的表达量绘图，，差别lncRNA类型基因组可视化时统计每个区段内lncRNA的数目绘图。。。。
1.差别基因火山图
通过绘制火山图可以相识差别表达基因的整体漫衍情形。。。。以log2 (foldchange)为横坐标，，-log10(pvalue)为纵坐标，，对差别表达剖析中所有的基因绘制火山图。。。。 其中横坐标代表基因在差别样本中差别表达倍数转变；；；纵坐标代表基因表达量转变差别的统计学显著性；；；up颜色代表上调的显著差别表达基因，，down颜色代表下调的显著差别表达基因，，no代表非显著性差别表达基因。。。。
2.差别基因聚类热图
差别基因聚类剖析用于判断基因在差别实验条件下调控模式的聚类模式。。。。凭证样品基因表达谱的相近水平，，将基因举行聚类剖析，，直观地展示基因在差别样品（或是差别处置惩罚）中的表达情形，，由此获取生物学相关信息。。。。为了更好的直观反应聚类表达模式，，关于非生物学重复
我们接纳log10(FPKM+1)举行展示，，关于生物学重复将差别基因FPKM通过Z值方法举行基因表达展示。。。。其中横坐标为样本，，纵坐标为基因，，差别的颜色体现差别的基因表达水平。。。。
常见问题
1.什么是长链非编码RNA？？？ ？？？它们的作用有哪些？？？ ？？？
哺乳动物基因组序列的约5%～10%被稳固转录，，卵白质编码基因仅约占1%，，其余4%～9%的序列都转录为非编码RNA。。。。而非编码RNA(non-coding RNA) 是指不可翻译为卵白的功效性RNA分子。。。。长链非编码RNA为这4%～9%中长度大于200nt的非编码RNA。。。。它们的作用主要体现在四个方面：第一，，影响周边基因的表达；；；第二，，调控卵白质活动及定位；；；第三，，爆发小分子RNA；；；第四，，对其他RNA的调控作用。。。。
2.lncRNA测序为什么需要构建链特异性文库？？？ ？？？
许多基因组区域具有正负链的转录本，，反义转录是真核基因的一个特征，，是一种主要的调控方法。。。。使用ssRNA-Seq（Strand-Specific）能够保存RNA的偏向性信息，，可以确定转录原来自正链照旧负链，，以便越发准确的获得基因的结构以及基因表达信息。。。。
3.展望lncRNA与mRNA、miRNA互作的要领？？？ ？？？
1）cis调控展望，，筛选的条件只有cis location是100kb。。。。（统一条染色体上距离lncRNA100kb的mRNA，，都会被列入到cis调控的可能）
2）trans调控展望用的是RIsearch软件，，是以最小自由能小于-11来筛选碱基互补配对的lncRNA与mRNA。。。。
3）在展望lncRNA与miRNA互作的时间，， 用score罚分值来判断，，一样平常≤4就认定为可信，，数值越小越可信。。。。
CircRNA测序
共价闭合、单链环状的RNA（circRNA）是一类较量特殊的RNA，，其没有游离的5′帽子结构和3′ poly（A）结构，，并且对核酸酶不敏感，，因此比通俗的线性RNA（linear RNA）更稳固。。。。随着高通量测序以及生物信息剖析手艺的快速生长，，在差别物种中判断出成千上万个circRNA，，其中大大都circRNA 在差别物种间具有守旧性和稳固性，，并且circRNA 的表达具有细胞特异性、组织特异性以及发育阶段特异性。。。。circRNA除了通例的对miRNA竞争连系的ceRNA调控机制外，，尚有翻译多肽等新功效，，在医学及动植物基础研究及后期转化上有着重大的潜力。。。。
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
|
动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
|
植物叶片组织/花 |
>200mg |
|
植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
|
原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
|
中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×107个 |
|
外泌体样本 |
>1×108个 |
|
血清/血浆/脑脊液/枢纽积液/卵泡液 |
>2mL |
|
细胞作育上清液 |
>20mL |
|
尿液 |
>30mL |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 组织样本建议生涯在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织生涯液中，，然后-80℃生涯或干冰寄送；；；
② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，，-80℃生涯或干冰寄送；；；
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服
应用场景
应用场景1：结构分子招募焦点卵白与核酸
适用规模：基础医学、生物化学与分子生物学等恣意研究偏向
lncRNA和circRNA有时间会作为一种特殊的RNA分子，，形成卵白-卵白复合物或卵白-核酸的骨架分子，，对下游分子行使一系列调控作用。。。。如部分circRNA会招募一些泛素化酶对下游的卵白行使降解功效，，或者部分lncRNA会招募一些转录因子与目的基因的启动子区域连系激活下游的基因表达等。。。。
应用场景2：外泌体
适用规模：临床与转化医学、基础医学等恣意研究偏向
lncRNA在外泌体中由于以碎片形式保存，，这种随机片断不但倒运于检测，，并且较低的浓度和较差的重复性，，使得lncRNA并不是外泌体研究的热门分子之一。。。。可是circRNA由于其稳固性，，除了从体液样本外泌体中疏散circRNA可作为疾病标记物外，，还能用于后期的外泌体治疗等领域，，是后ceRNA时代中较为热门的circRNA细分研究领域偏向之一。。。。其中一个偏向是疾病标记物，，一样平常以大样本行列研究居多。。。。一种是后期转化及机制研究偏向，，包括外泌体受体细胞分子机制研究以及疾病治疗等偏向。。。。
应用场景3：翻译多肽
适用规模：临床与转化医学、基础医学、生物化学与分子生物学等恣意研究偏向
circRNA上有一段未翻译的RNA序列，，称为IRES，，它可以折叠成类似于起始tRNA的结构，，并招募更多的核糖体。。。。正常情形下，，IRES不与eIF连系，，而是与一类称为ITAF的卵白质连系。。。。ITAF的作用是将核糖体召募到circRNA的内部结构，，以启动卵白质翻译。。。。别的，，还可能保存IRES增强子，，类似于circ-ZNF609的UTR元件。。。。也有研究通过翻译组测序与转录组测序，，发明了非编码RNA LINC-PINT形成环状RNA后可被翻译形乐成能多肽。。。。
应用场景4：ceRNA调控机制
ceRNA全称competing endogenous RNA，，是一种能够竞争连系RNA的作用元件。。。。通常lncRNA和circRNA会竞争连系miRNA，，我们一样平常把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。。。。ceRNA调控网络全称ceRNAregulation network，，指的是有ceRNA加入的整个调控网络cascade。。。。而ceRNA剖析指的是对整个ceRNA调控网络举行剖析。。。。一样平常有circRNA-miRNA-mRNA剖析或lncRNA-miRNA-mRNA剖析。。。。
案例展示
circRNA和母基因通过差别的pathway影响肝癌细胞的生长，，迁徙和侵袭
1.研究配景
肝细胞癌（HCC）是最常见的一种恶性肿瘤，，同时，，中国也是肝癌的癌症大国。。。。虽然现在的医疗诊断手艺生长很快，，可是，，对与肝癌的现有诊断手艺照旧受限很大。。。。因此，，开发新的诊断biomarker，，并明确这些biomarker的作用机制，，是许多科研职员想做的事情。。。。本研究从circRNA，，一类很是适合做biomarker的候选分子出发，，深入研究了一个锌指家族基因ZKSCAN1及其爆发的circZKSCAN1，，在HCC中的作用机制及作为biomarker的潜在价值。。。。
2.研究效果
1)基因表达模式剖析
ZKSCAN1，，是一个锌指卵白家族，，该家族基因在肿瘤爆发，，生长，，转移和药物耐受方面都施展着很是主要的作用。。。。同时，，现有的研究也发明，，ZKSCAN1基因的第二个和第三个外显子部分能形成一个circRNA，，在人脑部和肝脏表达富厚。。。。因此，，研究职员首先验证了ZKSCAN1和circ ZKSCAN1在HCC组织中的表达情形。。。。102个HCC组织和配对癌旁的RT-PCR效果显示，，他们在HCC样本中的表达显著降低。。。。进一步将ZKSCAN1和circ ZKSCAN1的表达与临床指标举行关联剖析，，发明低的ZKSCAN1表达与肿瘤巨细显著相关；；；而circ ZKSCAN1的表达与差别肿瘤数目，，硬化水平，，血管侵袭，，微血管侵袭，，肿瘤grade都显著相关。。。。ROC曲线剖析显示，，circ ZKSCAN1的AUC值抵达0.834，，敏感性和特异性能抵达82.2%和72.4%，，相比而言，，ZKSCAN1的AUC值只有0.474。。。。因此，，circ ZKSCAN1的表达更合适作为肿瘤组织的诊断biomarker。。。。
2)circRNA与母基因表达相关性剖析
关于circRNA的研究，，第一个想到的是circRNA的表达是否会和母基因表达有关联。。。。因此，，研究职员先在差别人HCC细胞系中检测了ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达。。。。发明所有的细胞系（Huh7, SMMC-7721, BEL-7402, HepG2和HepG3B）相比比照组（L02），，表达都降低。。。。通过在HepG2和SMMC7721中过表达和敲降ZKSCAN1和circZKSCAN1，，研究职员发明过表达或者敲降其中一个，，不会影响另一个的表达转变。。。。因此，，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的表达相互自力，，不相互影响。。。。
3)基因功效剖析
为探讨ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对HCC细胞的功效影响，，研究职员举行了相关检测。。。。效果显示，，在ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1的敲降细胞中，，增殖能力显著增强，，而过表达细胞中，，显著下降；；；过表达细胞的迁徙和侵袭能力显著降低；；；敲降细胞显著增添。。。。进一步的裸鼠莳植实验也批注，，过表达时肿瘤生长抑制，，而敲降时刺激肿瘤生长。。。。因此，，ZKSCAN1 mRNA和circZKSCAN1对肿瘤生长有显著影响。。。。
4)基因亚细胞定位
基因在细胞中的定位往往决议着他们的功效行使。。。。因此，，研究职员对ZKSCAN1的卵白举行亚细胞定位。。。。效果显示，，正常肝组织的细胞质中保存大宗的ZKSCAN1，，而HCC肝组织中却很少。。。。另外，，FISH剖析批注circ ZKSCAN1也是主要定位于细胞质中。。。。
5)下游调控基因剖析
为探讨ZKSCAN1调控细胞增殖和侵袭的内在分子机制。。。。研究职员对敲降ZKSCAN1 mRNA和circ ZKSCAN1的HCC细胞与比照举行了全基因组RNA测序。。。。效果显示，，敲降circZKSCAN1引起372个基因差别表达；；；敲降ZKSCAN1引起346个基因差别表达。。。。其中，，两组效果中共有166个是在两种情形下都泛起差别。。。。KEGG通路剖析显示，，敲降circ ZKSCAN1的差别基因富集到PI3K pathway, migration pathway, actin cytoskeleton pathway等；；；而敲降ZKSCAN1则主要富集到metabolic pathways。。。。因此，，circ ZKSCAN1和ZKSCAN1影响了下游差别的信号通路影响细胞增殖和侵袭。。。。
6)qRT-PCR验证下游基因
最后，，研究职员对特异性地在ZKSCAN1敲降后转变的基因与circZKSCAN1敲降后转变的基因及都转变的基因举行了qRT-PCR验证，，效果批注，，在ZKSCAN1敲降后，，细胞代谢相关基因确实爆发了显著转变；；；而在circZKSCAN1敲降后，，凋亡和迁徙相关基因爆发显著转变；；；COL3A1，，CDH5，，MYB，，PDK1和BCL2在两种情形下都显著转变。。。。
研究结论
在本研究中，，研究职员发明，，虽然ZKSCAN1和circRNA在HCC中都爆发了显著下调，，都是影响细胞生长，，迁徙和侵袭，，可是，，他们影响的下游信号通路却是各不相同。。。。该研究为明确circRNA和其母基因在生命体中的调控作用提供了新的依据。。。。
参考文献
Yao Z, Luo J, Hu K，，et al.（2017）ZKSCAN1 gene and its related circular RNA (circZKSCAN1) both inhibit hepatocellular carcinomacell growth, migration and invasion but through different signaling pathways. Mol Oncol. doi: 10.1002/1878-0261.12045
效果展示
1.基因表达值密度
差别样本各自表达量处置惩罚后数值log10（fpkm）做表达值密度图，，可以较量差别样本间表达趋势的转变。。。。理想状态下，，各样本的表达密度图应切合正态漫衍，，同时生物学重复样本的表达趋势应趋于一致。。。。
2.差别circRNA-hosting gene GO富集性柱状图
GO富集性剖析效果柱状图反应在生物历程(biological process)、细胞组分 (cellularcomponent)和分子功效(molecular function)富集的GO term上差别基因的个数漫衍情形。。。。
3.差别circRNA-hosting gene KEGG富集性散点图
通过ggplot2对KEGG富集剖析效果以散点图的形化举行展示，，其中横坐标Rich factor体现位于该KEGG的差别基因个数/位于该KEGG的总基因数（Rich factor=S gene number/B gene number），，Rich factor越大，，KEGG富集水平 越高。。。。纵坐标是Pathway term，，即KEGG代谢通路。。。。散点图中，，点的巨细代表 S gene number 匹配到单个KEGG的具有显著性差别的基因数，，点的颜色代表 富集剖析的p值，，即富集的显著性。。。。KEGG富集剖析散点图是凭证富集的显著 性（pvalue）取top20的Pathway term举行绘图。。。。
常见问题
1.CircRNA的成环机制都有哪些？？？ ？？？
CircRNA的成环机制有：套索驱动的环化；；；内含子配对驱动的环化；；；内含子环化；；；RBP或一类反式因子驱动的环化；；；可变剪接引起的环化。。。。
2.circRNA测序和通俗的RNA-seq，，在抽提total RNA时有区别吗？？？ ？？？
circRNA测序对total RNA的要求与通俗的RNA-seq相同，，以是抽提要领也相同。。。。可是由于circRNA建库需要去除rRNA和线性RNA，，以是需求大宗的total RNA，，需提供大于即是10 μg的total RNA。。。。
3.circRNA与lncRNA的区别是什么？？？ ？？？
结构上，，circRNA没有自由的5’端和3’端；；；功效上，， circRNA功效研究较量简单，，现在关于其是否能够像lncRNA一样在染色体水平、卵白质水平上具有调控作用，，尚未可知，，这些也是现在研究的偏向。。。。凭证已有研究发明，， circRNA可以施展海绵效应吸附miRNA，，可以作为竞争性内源RNA。。。。
Small RNA测序
Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，，其中miRNA研究最为普遍，，是一类不具有卵白编码能力的RNA分子，，能调控基因表达，，在细胞生长、发育和代谢等基础生物学历程中都饰演着主要的角色，，甚至在癌症等相关疾病形成历程中也起着要害的作用。。。。
UG环球组学效劳优势
1. 高度无邪性：可研究任一 17-35 nt 之间的小 RNA 分子
2. 高度准确性：可准确到单核苷酸水平，，有利于区分高度同源的小 RNA 分子和判断小 RNA 的多态性
3. 检测动力学规模广：可在凌驾 6 个数目级规模内实现准确的序列检测和定量剖析，，有利于低品貌小 RNA 差别表达的研究
4. 数据质量高：深度测序包管了抽样随机性、可靠性和重复性，，与实时定量 PCR 效果具有较高的一致性
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
|
动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
|
植物叶片组织/花 |
>200mg |
|
植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
|
原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
|
中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×107个 |
|
外泌体样本 |
>1×108个 |
|
血清/血浆/脑脊液/枢纽积液/卵泡液 |
>2mL |
|
细胞作育上清液 |
>20mL |
|
尿液 |
>30mL |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 组织样本建议生涯在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织生涯液中，，然后-80℃生涯或干冰寄送；；；
② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，，-80℃生涯或干冰寄送
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服
应用场景
应用场景1：外泌体
适用规模：临床与转化医学、基础医学、动物/兽医研究等恣意研究偏向
MicroRNA（miRNA）是一类非编码RNA，，能够调理一系列普遍的生物历程。。。。除了在细胞内施展作用外，，最近研究还显示miRNA在细胞外泌体中渗透，，从而允许其转移至近端或远端的细胞进而调理基因表达。。。。外泌体代表着有希望可以从中疏散miRNA的纳米质料，，有施展治疗作用的潜力。。。。
应用场景2：大样本研究
适用规模：临床与转化医学，，疾病标记物挖掘与判断
miRNA是一种稳固性强重复性好易于检测的非编码RNA，，在体液样本及组织样本中品貌高，，在临床上具备成为特异性强迅速度的生物标记物（biomarker）的潜能。。。。例如外泌体或体液样本中，，凌驾70%的RNA为miRNA，，配合回归和种种机械学习建模，，可挖掘高迅速度的潜在生物标记物。。。。
应用场景3：抑制翻译/激活翻译
适用规模：临床与转化医学、基础医学与分子生物学、动植物研究等恣意研究偏向
miRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始，，进而起到对翻译历程的抑制作用。。。。miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子结组成为支持这一理论的主要依据，，由此可以推断 miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而施展作用；；；Ago2中心结构域具有连系m7G帽子的活性，，Ago2通过 对miRNA招募靶mRNA的 3' UTR，，从而与起始复合物eIF4E/G竞争性连系m7G帽子，，最终施展对翻译起始复合物的抑制作用。。。。现实上miRNA具有双重功效，，当位于胞浆时可抑制基因表达，，当位于细胞核内可激活基因的转录。。。。核内miRNA可通过连系增强子，，改变增强子的染色质状态，，从而激活基因的转录表达。。。。
应用场景4：与单细胞测序联合剖析
适用规模：临床与转化医学、基础医学与分子生物学、动植物研究等恣意研究偏向
miRNA与单细胞联合剖析，，主要通过两种要领。。。。第一种是通过对miRNA的靶基因所对应的基因集在单细胞测序中用AddModuleScore打分模浚浚� ？？？槭迪帧�。。。第二种就是引入了RIP和CLIP数据库来举行后期校正。。。。即间接打分和直接打分两种要领。。。。
通过miRNA与单细胞联合，，能够锁定通路富集较高的细胞亚群，，并和miRNA建设起直接调控和间接调控两种方法。。。。
应用场景5：ceRNA调控机制
适用规模：临床与转化医学、基础医学与分子生物学、动植物研究等恣意研究偏向
ceRNA全称competing endogenous RNA，，是一种能够竞争连系RNA的作用元件。。。。通常lncRNA和circRNA会竞争连系miRNA，，我们一样平常把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。。。。ceRNA调控网络全称ceRNAregulation network，，指的是有ceRNA加入的整个调控网络cascade。。。。而ceRNA剖析指的是对整个ceRNA调控网络举行剖析。。。。一样平常有circRNA-miRNA-mRNA剖析或lncRNA-miRNA-mRNA剖析。。。。
应用场景6：植物miRNA与降解组联合
适用规模：植物抗病抗旱等抗逆研究、植物遗传育种、植物发育学等恣意研究偏向
通过降解组测序和miRNA测序的联合应用，，研究者不但可以系统判断多莳植物中miRNA调控的靶基因，，还可以探讨多种miRNA及其靶基因对植物差别处置惩罚的差别性表达，，证实某些miRNA的靶基因在植物生长发育历程中的主要作用。。。。
项目文章
【1】Su T, et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells-Derived Exosomal MiR-29b-3p Regulates Aging-Associated Insulin Resistance. ACS Nano. 2019 Feb 26;13(2):2450-2462. PMID: 30715852.
【2】Ma L, et al. Nanotopography Sequentially Mediates Human Mesenchymal Stem Cell-Derived Small Extracellular Vesicles for Enhancing Osteogenesis. ACS Nano. 2022 Jan 25;16(1):415-430. PMID: 34935354.
效果展示
1.差别miRNA上下调统计剖析
差别基因上下调频数统计用于判断差别实验条件下差别表达miRNA的个数。。。。其中横坐标体现较量组信息，，纵坐标体现上下调miRNA的数目，，红色代表上调miRNA，，蓝色代表下调miRNA，，其中数字代表上下调miRNA的数目。。。。
2.差别miRNA聚类剖析
差别miRNA聚类剖析用于判断miRNA在差别实验条件下调控的聚类模式。。。。凭证样品miRNA表达谱的相近水平，，将miRNA举行聚类剖析，，直观地展示miRNA在差别样品（或是差别处置惩罚）中的表达情形，，由此获取生物学相关信息。。。。差别的颜色体现差别的miRNA表达水平，，颜色由蓝色经由白色至红色体现表达量从低到高。。。。红色体现高表达基因，，深蓝色体现低表达基因。。。。
3.差别miRNA韦恩图
通过差别较量组之间差别基因韦恩图可以直观地显示出差别较量组之间配合的和特有的差别表达miRNA的个数，，差别基因韦恩图具有显着的生物学意义，，好比是相同比照差别处置惩罚的实验设计情形，，可以将差别处置惩罚下的差别基因举行较量。。。。
4.GO富集性柱状图
miRNA靶基因的GO富集柱状图：用于反应在生物历程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功效(molecular function)富集的GO term上差别基因的个数漫衍情形。。。。
5.GO富集性散点图
对差别miRNA举行GO富集剖析并以散点图展示，，Rich factor体现位于该GO的差别基因个数/位于该GO的总基因数，，P值越小，，GO富集水平越高。。。。
常见问题
1.miRNA命名规则是怎样的？？？ ？？？
关于miRNA命名，，是凭证miRBase的命名规则：物种拉丁名3字母缩写-miR/MIR-编号（植物），，miR体现的是microRNA成熟体，，植物的前体使用MIR。。。。拜见miRBase官网:现在已经不再使用*来标记microRNA与其发夹前体互补配对位置的互补序列，，而是使用“-3p”与“-5p”作为区分这两条序列的后缀替换旧的的命名法。。。。详细参考17.0版本出来时，，miRbase数据库的blog文章：http://www.mirbase.org/blog/2011/04/mirbase-17-released/
2.怎样筛选差别基因？？？ ？？？
可以在筛选的时间可能需要参考该参数，，一样平常若是专注于发明，，那么所有保存，，若是专注于差别表达，，可以仅保存high和middle拷贝的。。。。log2(Treat/Control)>0体现上调，，<0体现下调，，>1体现上调2倍，，<-1体现下调2倍。。。。最简朴的较量巨细，，就是Treat-Control（看大于照旧小于0），，或者Treat/Control（看大于照旧小于1），，更有可读性的就是log2(Treat/Control)（>0体现上调，，<0体现下调，，>1体现上调2倍，，<-1体现下调2倍）负相关、差别显著性pvalue值、foldchage、最低拷贝值。。。。
全转录组测序
对组织或细胞在某一时刻或处置惩罚条件下转录出来的所有RNA举行测序剖析，，全转录组的研究中包括对mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA举行剖析，，并连系多种RNA信息探索相互之间潜在的调控网络。。。。
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
|
动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
|
植物叶片组织/花 |
>200mg |
|
植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
|
原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
|
中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞 |
>5×107个 |
|
外泌体样本 |
>1×108个 |
|
血清/血浆/脑脊液/枢纽积液/卵泡液 |
>2mL |
|
细胞作育上清液 |
>20mL |
|
尿液 |
>30mL |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 组织样本建议生涯在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织生涯液中，，然后-80℃生涯或干冰寄送；；；
② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后，，-80℃生涯或干冰寄送；；；
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服。。。。
应用场景
应用场景1：结构分子招募焦点卵白与核酸
适用规模：基础医学、生物化学与分子生物学等恣意研究偏向
lncRNA和circRNA有时间会作为一种特殊的RNA分子，，形成卵白-卵白复合物或卵白-核酸的骨架分子，，对下游分子行使一系列调控作用。。。。如部分circRNA会招募一些泛素化酶对下游的卵白行使降解功效，，或者部分lncRNA会招募一些转录因子与目的基因的启动子区域连系激活下游的基因表达等。。。。
应用场景2：外泌体
适用规模：临床与转化医学、基础医学等恣意研究偏向
lncRNA在外泌体中由于以碎片形式保存，，这种随机片断不但倒运于检测，，并且较低的浓度和较差的重复性，，使得lncRNA并不是外泌体研究的热门分子之一。。。。可是circRNA由于其稳固性，，除了从体液样本外泌体中疏散circRNA可作为疾病标记物外，，还能用于后期的外泌体治疗等领域，，是后ceRNA时代中较为热门的circRNA细分研究领域偏向之一。。。。其中一个偏向是疾病标记物，，一样平常以大样本行列研究居多。。。。一种是后期转化及机制研究偏向，，包括外泌体受体细胞分子机制研究以及疾病治疗等偏向。。。。
应用场景3：翻译多肽
适用规模：临床与转化医学、基础医学、生物化学与分子生物学等恣意研究偏向
circRNA上有一段未翻译的RNA序列，，称为IRES，，它可以折叠成类似于起始tRNA的结构，，并招募更多的核糖体。。。。正常情形下，，IRES不与eIF连系，，而是与一类称为ITAF的卵白质连系。。。。ITAF的作用是将核糖体召募到circRNA的内部结构，，以启动卵白质翻译。。。。别的，，还可能保存IRES增强子，，类似于circ-ZNF609的UTR元件。。。。也有研究通过翻译组测序与转录组测序，，发明了非编码RNA LINC-PINT形成环状RNA后可被翻译形乐成能多肽。。。。
应用场景4：ceRNA调控机制
ceRNA全称competing endogenous RNA，，是一种能够竞争连系RNA的作用元件。。。。通常lncRNA和circRNA会竞争连系miRNA，，我们一样平常把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。。。。ceRNA调控网络全称ceRNA regulation network，，指的是有ceRNA加入的整个调控网络cascade。。。。而ceRNA剖析指的是对整个ceRNA调控网络举行剖析。。。。一样平常有circRNA-miRNA-mRNA剖析或lncRNA-miRNA-mRNA剖析。。。。
案例展示
circular RNA(HRCR)靶标连系miR-223�；；；ば脑嗝馐苄募》屎窈托脑嗨ソ�
本研究中作者首先通过miRNA基因芯片剖析、Northern blot、RT-PCR等手艺手段发明，，ISO处置惩罚14天后，，miRNA-223的表达量显著上调，，并且在患有心脏肥厚和心脏衰竭的人和小鼠心脏中miRNA-223的表达量也有显着的上调，，起源得出结论：miRNA-223加入调控心肌肥厚和心脏衰竭。。。。接下来作者使用miR-223过表达转基因小鼠以及miR-223基因敲除转基因小鼠进一步验证表型，，效果发明miR-223过表达小鼠成年后泛起显着的心肌肥厚和心脏衰竭症状，，而miR-223基因敲除小鼠表型相反，，进一步证实在活体内，，miR-223可以诱导心肌肥厚和心脏衰竭。。。。
接下来作者进一步研究miR-223对心肌细胞的影响，，效果发明miR-223过表达细胞中泛起显着的心肌肥大反应，，而miR-223敲除细胞中，，ISO处置惩罚引起的心肌肥大反应显着被破损，，说明miR-223过表达会增进心肌肥厚，，而miR-223基因敲除会阻断心肌肥厚。。。。
为了进一步研究miR-223调控心肌肥厚和心脏衰竭的分子机制，，作者筛选了一些加入调控心肌肥厚的基因作为miR-223的靶标候选基因，，然后通过western blot剖析miR-223过表达和缺失突变体中上调以及下调的基因，，效果发明miR-223可以显著抑制ARC的表达，，而前人已经有研究报道ARC加入调控心肌肥厚和细胞凋亡，，以是起源推断ARC可能是miR-223下游的靶标位点。。。。
CircRNA和miRNA的互作是现在研究的一个热门话题，，为了进一步研究是否有CircRNA加入调控miR-223的表达，，作者从CircRNA数据库中随机筛选出100个CircRNA，，通过qRT-PCR验证筛选到36个CircRNA，，然后通过Northern blot筛选到一个特异性表达的CircRNA: mm9-circ-012559(HRCR)。。。。
然后作者通过RNAhybrid剖析发明HRCR包括6个CircRNA的靶标连系位点，，起源批注HRCR可以和miR-223连系。。。。接下来作者通过生物素标记，，qRT-PCR，，Northern bolt，，pull down assay、荧光原位杂交（FISH）等手艺手段，，从正向以及反向两个角度划分验证HRCR和miR-223之间的互作关系，，效果发明miR-223和HRCR在细胞质中保存共定位征象，，HRCR可以直接连系到miR-223上。。。。
HRCR和miR-223保存互作，，而miR-223可以通过调控下游ARC的表达，，进而调控心肌肥厚和心脏衰竭，，为了进一步研究HRCR对ARC表达的影响，，作者构建了HRCR过表达载体和基因敲除突变体，，效果发明HRCR过表达载体中，，ARC的表达量和活性显著增添，，HRCR敲除突变体中，，ARC的表达量和活性显著降低，，并且HRCR可以消除miR-223对ARC表达的抑制作用，，说明HRCR可以通过调控miR-223以及ARC的表达，，进而调控心肌肥厚。。。。
参考文献
Wang K, Long B, Liu F, et al. A circular RNA protects the heart from pathological hypertrophy and heart failure by targeting miR-223.[J]. European Heart Journal, 2016, 37(33):2602-2611.
常见问题
1.全转录组测序为什么需要构建两个文库
全转录组测序需要构建2个测序文库，，一个小RNA文库和一个去除核糖体RNA的链特异性文库，，然后划分上机测序。。。。小RNA长度较短，，一样平常小于50nt，，接纳测序战略为50SE。。。。其他三类RNA序列一样平常大于200，，通常在1000以上，，最高可达几万，，通过片断化构建150PE测序文库。。。。最后小RNA文库可以获得miRNA序列信息，，去核糖体的链特异性文库可以获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。。。。
2.什么是ceRNA调控网络（ceRNA networks）。。。。
这些非编码RNA如lncRNA和circRNA等会竞争连系miRNA，，导致miRNA调控的靶基因爆发转变，，最终体现在卵白的表达水平上，，而miRNA处于ceRNA调控网络中的焦点职位。。。。如下图
原核转录组
基于高通量测序平台，，构建链特异性文库，，研究原核生物在某个时期或者在某种情形条件下转录出来的所有mRNA。。。。
样本起始量与送样建议
|
样本类型 |
起始量 |
|
细菌 |
>200 mg |
|
总RNA |
>1μg且RIN>7.0 |
注重事项：
① 建议网络对数生恒久的样品送样；；；
② 将样本放入液氮预冷的无酶管，，ddH2O或灭菌的PBS后，，-80℃生涯或干冰寄送；；；
③ 越发详细的样本准备指南，，请联系在线客服。。。。
翻译组
经典中心规则指出DNA转录爆发mRNA，，而mRNA指导卵白质的合成，，卵白质是生命活动的主要肩负者。。。。然而科学家们发明人类基因组中70%以上的DNA可以转录爆发RNA而具有编码卵白能力的mRNA只占3%左右，，说明大都转录的RNA分子都属于非编码RNA，，关于RNA的翻译主要分为：不翻译，，部分翻译，，重新翻译，，太过翻译。。。。
随着NGS的普遍应用，，翻译组学研究迅速成为现代生命科学的热门之一，，其中，，核糖体印迹测序手艺是该研究的利器之一（Ribo-seq），，该手艺由Weissman课题组于2009年揭晓在Science杂志上。。。。以后相继应用到微生物、酵母、小鼠、人类组织、玉米、拟南芥、斑马鱼等多个物种研究上。。。。
