标记卵白组TMT
TMT（Tandem Mass Tag）手艺由美国Thermo Fisher Scientific开发的一种多肽体外标记手艺。。。。。该手艺接纳了6标(TMTsixplex™ Isobaric Label Reagent Set）、10标(TMT10plex™ Isobaric Label Reagent Set ）、16标（TMTpro 16plex）、18标（TMTpro 18plex）等同位素标签，，， ，通过与肽段特异氨基酸位点相连实现差别泉源的肽段标记，，， ，然后举行串联质谱剖析，，， ，监测碎裂下来的标签实现肽段定量。。。。。一次实验可无邪较量最多18种差别样本中卵白质的相对含量。。。。。
TMT试剂主要由3部分组成：报告基团、平衡基团和肽反应基团。。。。。以6标试剂为例：报告基团相对分子质量划分为126、127、128、129、130和131；；平衡基团相对分子质量划分为103、102、101、100、99和98，，， ，这样就形成了6种相对分子质量均为229的等量异位标签。。。。。报告离子的强度就代表了响应样品中卵白质/肽段的强度，，， ，实现了对差别样本中卵白质的定性和定量剖析。。。。。
手艺优势
1. 迅速度高：低品貌卵白也能检测出
2. 适用规模广：险些可对任何物种的种种卵白质举行疏散判断
3. 高通量：能同时对18组样本中包括的卵白举行判断及表达差别剖析
4. 高效：液相色谱与串联质谱连用，，， ，自动化操作，，， ，剖析速率快，，， ，疏散效果好
样本起始量与送样建议
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样本类型 |
起始量 |
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动物及临床脏器组织/脑组织等 |
>20mg |
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动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等 |
>100mg |
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植物叶片组织/花 |
>200mg |
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植物根/茎/果实/种子 |
>500mg |
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原代细胞/细胞系 |
>5×106个 |
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总RNA |
>100μg |
注重事项：详细样本准备指南，，， ，请联系在线客服。。。。。
生物信息学剖析内容
项目文章
Luo Z, Peng W, Xu Y, Xie Y, Liu Y, Lu H, Cao Y, Hu J. Exosomal OTULIN from M2 macrophages promotes the recovery of spinal cord injuries via stimulating Wnt/β-catenin pathway-mediated vascular regeneration. Acta Biomater. 2021 Dec;136:519-532. PMID: 34551329.
常见问题
1. iTRAQ及TMT等标记定量卵白质组手艺有什么特点？？？？
iTRAQ以及TMT等标记定量卵白质组手艺区分率高，，， ，细胞样品最多可判断凌驾6000个卵白，，， ，并且绝大大都卵白都有定量和定性信息；；其次是通量高，，， ，可以一次最多完成8个（iTRAQ）或者10个（TMT）样品的实验，，， ，特殊适合于多组样品间的同时较量以及生物学历程的动态检测。。。。。
2. 没有全基因组数据的物种该怎样举行卵白的判断？？？？
关于已经宣布全基因组序列的物种，，， ，可以在获得全序列后构建外地建库并举行外地检索；；关于未举行全基因组测序的物种，，， ，可以接纳近缘物种的数据库或者EST数据以及转录组数据举行检索。。。。。
4D-DIA
DIA主要接纳数据非依赖收罗模式（DIA），，， ，连系古板的数据依赖收罗模式（DDA）构建参考谱图库，，， ，通过液质联用手艺（LC-MS/MS）将质谱整个全扫描规模分为若干个窗口，，， ，高速、循环地对每个窗口中的所有离子举行选择、碎裂、检测，，， ，从而无遗漏、无差别地获得样本中所有离子的所有碎片信息。。。。。随后使用搜库软件举行卵白组学的判断、定量剖析等。。。。。
手艺优势
迅速度高，，， ，无歧视地获得所有肽段的信息，，， ，不会造成低品貌卵白信息的丧失，，， ，
循环时间牢靠，，， ，扫描点数匀称，，， ，定量准确度高，，， ，
重复性好，，， ，重复样品间的定量相关性可抵达0.99以上。。。。。
剖析内容
1. 数据质控
2. 卵白功效注释：GO 注释、COG 注释、KEGG 注释、结构域注释
3.卵白定量剖析：卵白定量效果、卵白表达水平聚类剖析、重复性剖析
4. 卵白差别剖析：卵白差别剖析效果、差别卵白火山图、差别卵白聚类热图
5. GO 富集剖析：GO 富集效果、GO 富集柱状图、GO 富集有向无环图、
6. KEGG 富集剖析：KEGG 富集效果、KEGG 富集气泡图、KEGG 富集通路图
7. 结构域富集剖析：结构域富集效果、结构域富集柱状图、差别卵白互作剖析、
8. 差别卵白互作剖析
9. 转录组关联剖析
代表性文章
【1】Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.
【2】Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
案例展示
卵白定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain
研究配景
慢性疼痛是一种治疗计划有限的重大疾病。。。。。虽对其发病机理举行了多次研究，，， ，但各效果间保存较大纷歧致性，，， ，主要受限于古板卵白质组shotgun手艺固有的缺陷。。。。。发病机制依然不清晰。。。。。
实验设计
炎症性疼痛和神经性疼痛两种模子鼠及其对应control鼠共4组，，， ，各3个生物学重复
每个生物学重复由10-13只鼠pooling而成
剖解获得同侧背根神经节膜部分提取卵白举行DIA卵白定量
图1 实验设计类型
主要发明
1）DDA建库判断到3067个卵白，，， ，迄今判断数最多的背根神经节卵白研究。。。。。
2）DIA四组都判断到的卵白有2526个，，， ，其中CFA和Vehicle都判断到的有2581个；；SNI和Sham都判断到的2600个，，， ，批注实验重复性较好。。。。。
3）炎症性和神经性疼痛差别卵白划分为64和77，，， ，两种模式共有差别卵白为12个。。。。。
4）其中Serca卵白在两种模式小鼠中表达量转变相反，，， ，批注两种疼痛的调控机制差别。。。。。
5）western blot和免疫组化对上述DIA效果举行了验证。。。。。
图2 四组实验模子的卵白聚类剖析
参考文献
Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
效果展示
结构域注释柱状图
Interproscan是卵白质结构域和功效注释最常用的软件之一。。。。。为了能更周全的举行结构域的注释，，， ，Interproscan整合了一些最常用的结构域数据库，，， ，包括 Pfam、 ProDom、 SMART 等结构域的数据库，，， ，使用模式结构或特征举行功效未知卵白的结构域注释，，， ，绘制结构域注释的柱状图。。。。。横坐标代表卵白数目，，， ，纵坐标代表注释到的 IPR 条目。。。。。
卵白表达水平聚类图
卵白表达水平聚类剖析用于判断差别实验条件下卵白表达量的相关性。。。。。每个样品都会获得一个绝对或相对卵白表达荟萃，，， ，将所有样品表达荟萃并在一起，，， ，用于条理聚类剖析和 K-means 聚类剖析。。。。。
KEGG 富集通路图
在 KEGG 通路图中，，， ，圈出了差别卵白，，， ，其中绿色底色框内为判断出的总卵白，，， ，蓝色框标记的是下调差别卵白，，， ，红色框标记的是上调差别卵白，，， ，黄色框标记的是通路中该功效对应的多个卵白中既有上调差别卵白、也有下调差别卵白。。。。。
差别卵白互作剖析
使用 StringDB 卵白质互作数据库举行判断卵白的互作剖析，，， ，若在数据库中有响应的物种，，， ，则直接提取响应物种的序列，，， ，若无，，， ，则提取近源物种的序列，，， ，然后将差别卵白的序列与提取出的序枚举行 blast 比对，，， ，得出响应的互作信息，，， ，构建网络图。。。。。
常见问题
1. 卵白定量DIA和古板的非标记定量有何优势？？？？
古板的非标记定量一样平常需要通太过级的要领开展，，， ，耗时久、重复性差、数据效果可信度不高；；卵白定量DIA手艺是新一代非标记定量手艺，，， ，可通过更优的数据收罗模式，，， ，在相同时间收罗到更富厚的信息，，， ，压缩周期的同时，，， ，大福度提高样本间平行较量的重复性，，， ，数据效果可信度极高。。。。。
DirectDIA
DirectDIA（direct Data-independent acquisition），，， ，即DDA-free DIA（dDIA），，， ，与古板DIA剖析战略相比，，， ，不必再举行DDA分级建库，，， ，使用机械深度学习实现直接通过搜索DIA原始文件谱图天生库。。。。。深度学习打分寻找谱峰碎裂纪律，，， ，展望保存时间，，， ，去除假阳性效果。。。。。刷新后的这种方法提高了效率，，， ，降低了本钱，，， ，保存了DIA可重复的定量的优势，，， ，判断到的卵白数目与古板DIA的差别也越来越小。。。。。
修饰卵白组
卵白质翻译后修饰 (Protein translational modifications，，， ，PTMs) 通过功效基团或卵白质的共价添加、调理亚基的卵白水解切割或整个卵白质的降解来增添卵白质组功效多样性。。。。。这些修饰险些影响正常细胞生物学和发病机制的所有方面。。。。。因此，，， ，识别和明确PTM在细胞生物学和疾病治疗和预防的研究中至关主要。。。。。由于保存大宗差别的PTM，，， ，无法对所有可能的卵白质修饰举行周全先容，，， ，因此仅对当今卵白质研究中研究的最常见PTM，，， ，如磷酸化、乙�；；⒎核鼗⑻腔�，，， ，举行概述：
（1）磷酸化：可逆的卵白质磷酸化，，， ，主要爆发在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，，， ，是现在研究得最深入的翻译后修饰之一。。。。。磷酸化在细胞周期、生长、凋亡和信号转导等历程中起着主要的调控作用。。。。。
（2）乙�；；�：险些所有的真核细胞卵白质都通过不可逆和可逆的机制爆发 N-乙�；；�，，， ，或乙�；；频降�。。。。。N 端乙�；；枰� N 端蛋氨酸被蛋氨酸氨基肽酶 (MAP) 裂解，，， ，然后用 N-乙�；；泼� (NAT) 用乙酰辅酶 a 的乙�；；〈被�。。。。。这种类型的乙�；；枪卜氲�，，， ，由于 N 端在仍与核糖体相连的生长中的多肽链上乙�；；�。。。。。
（3）泛素化：泛素是一类分子量为 8 kDa 的多肽，，， ，由 76 个氨基酸组成，，， ，通过泛素 C 最后的甘氨酸毗连到靶卵白赖氨酸的 ε-NH2 上。。。。。在最初的单泛素化事务之后，，， ，可能形成泛素聚合物，，， ，然后 26S 卵白酶体识别多聚泛素化卵白，，， ，26S 卵白酶体催化泛素化卵白的降解和泛素的再循环。。。。。
（4）糖基化：卵白质糖基化是卵白质翻译后的主要修饰之一，，， ，对卵白质的折叠、构象、漫衍、稳固性和活性都有主要影响。。。。。
PRM靶向卵白组
PRM（平行反应监测，，， ，Parallel Reaction Monitoring），，， ，是现在靶向卵白质组学数据收罗的主流要领，，， ，通过对特异性肽段或目的肽段（如爆发翻译后修饰的肽段）举行选择性检测，，， ，从而实现对目的卵白质/修饰肽段的靶向相对或绝对定量。。。。。PRM可用于组学数据验证，，， ，好比基因组/转录组/定量卵白质组/修饰卵白质组获得的目的基因/卵白，，， ，实现其相对/绝对定量剖析。。。。。
Olink靶向卵白组
Olink卵白质组学手艺是一种高通量的卵白质检测要领，，， ，可以同时检测数百种卵白质，，， ，并且具有高迅速度和高特异性。。。。。其手艺原理主要是：
Probe 设计：Olink手艺使用了一种称为 proximity extension assay（PEA）的要领，，， ，使用两种具有特异性的抗体，，， ，即Proximity Probe，，， ，划分识别待检测卵白质的差别位点。。。。。这两种Proximity Probe 上划分毗连有一种DNA分子，，， ，当两种Probe靠近并连系到待测卵白上时，，， ，两种DNA分子可以形成一个连通的DNA链。。。。。
扩增：所有DNA链同时被扩增成数百万个复制物，，， ，并且在扩增历程中添加了标记的核酸，，， ，这些标记的核酸是与每个DNA链上的特定序列相匹配的。。。。。
检测：使用Universal PCR Probe探针与所有扩增的DNA序列相匹配，，， ，PCR反应爆发荧光信号，，， ，标记的核酸序列数目与待检测卵白质的数目成正比。。。。。
手艺效劳优势
1. 高通量：快速检测批量样品中的48-3072种卵白标记物；；
2. 低体积：每个样品仅需不到1-6微升；；
3. 靶向性：所有检测卵白，，， ，均为生物标记物，，， ，笼罩100% 信号通路；；
4. 高迅速及宽动态：检测迅速度可达fg/ml级别；；动态规模横跨10个log，，， ，笼罩高、中、低品貌卵白；；
5. 自动化：自动化样品处置惩罚流程提供了绝佳的浅易性、准确性和重复性。。。。。
